基于GWAS和DIA蛋白质组学解析鸡精液抗冻性的分子机制

【作者】 李欣欣； 徐俊杰； 范毅豪； 吴星霖； 王德贺； 陈辉； 石雷；

【机构】 河北农业大学动物科技学院；

【摘要】 引言:目前,国内已经建立了相对稳定的鸡精液冷冻保存技术,冻精受精率平均60%,最高可达88%,但与95%的鲜精受精率相比仍存在较大差距,其原因与个体间精液抗冻性相关,亟需从遗传水平挖掘影响精液抗冻性的关键调控因子。精液由精浆和精子组成,精浆可为精子供能、吸收代谢产物、缓冲刺激,维持精子生存稳态,对精子生存至关重要。然而,目前家禽精液抗冻性研究多集中于精子层面,针对精浆对精液抗冻性的调控鲜有报道。全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)通过比较大量个体基因组数据,寻找与特定表型有关的显著遗传变异,从而揭示基因与表型之间的关系,已成为挖掘畜禽重要经济性状关键变异的实用方法,有研究通过GWAS鉴定了与公猪精子耐冻性相关的位点和基因。因此,本试验将利用GWAS鉴定精液耐冻个体遗传机制,同时用DIA蛋白质组学技术解析精浆调控机制,挖掘精液抗冻性关键因子,为鸡精液冷冻保存研究提供参考。材料与方法:选择215只65周龄白来航公鸡为试验对象,翅静脉采血,使用京芯一号55K芯片进行基因分型。在正式试验前1周采精训练2次,试验期间按个体采精并均分两份,一份为鲜精,另一份超低温冷冻,随后检测冷冻前后精子的活力、活率和畸形率指标。试验每隔3天进行1次,重复3次。利用plink软件对基因型数据进行质量控制筛选,采用R软件对抗冻性性状进行GWAS,筛选关键位点和候选基因。根据冷冻前后精液品质变化情况评价精液抗冻性,并筛选出高抗冻性HF组和低抗冻性LF组个体各4只;对上述个体冷冻前后精液分离精浆进行DIA蛋白组学分析,针对冻前与冻后数据进行配对T检验,差异倍数|log2FC|>1.2且P<0.05为显著性阈值;同时,将仅在HF组或LF组表达的蛋白记为特异性差异表达蛋白SEPs,均存在于HF和LF组的蛋白记为共有差异表达蛋白CEPs,通过富集分析,筛选关键抗冻蛋白。结果与讨论:抗冻性的全基因组关联分析结果筛选到10个位点与抗冻性显著相关(P<1.817×10-5),分别位于Z染色体的AQP3、AQP7基因,4号染色体的HSPA4L基因,24号染色体的APOA1、HYOU1、CADM1、REXO2基因,13号染色体的CD74、GPX3基因,6号染色体的PRDX3基因。其中,AQP3、AQP7基因可用作公猪精子冷冻性标志物。HYOU1参与抗氧化保护和抗细胞凋亡。猜测这些基因与公鸡精液抗冻性密切相关。HF组SEPs共计124个,主要富集于碳水化合物代谢过程等条目,URM1、RGN等差异蛋白显著上调。KEGG通路分析富集在代谢等通路,UBA52蛋白显著上调。URM1在线粒体功能和氧化应激反应起调节作用,UBA52是维持线粒体稳态的关键因子。Silva等发现,RGN上调可改善因年龄增长引起的精子质量下降,推测RGN参与缓解精子冷冻损伤过程。LF组SEPs共计119个,主要富集于去磷酸酶活性的调控等条目和代谢等通路,其中GSK3A显著上调。Wang等同样发现,在精子冷冻保存过程中GSK3A被异常激活,并与精子活力呈现负相关,推测GSK3A是导致精液冷冻后精子活力降低的关键蛋白。本试验共筛选265个CEPs,PARK7、CKB、ENO1等蛋白在HF上调倍数高于LF组1.5～2倍,GPI在LF组上调倍数高于HF组1.4倍。前人研究表明,PARK7通过调控人类冻融精子活性氧水平影响精子运动,CKB可催化ATP能量转移以维持精子能量平衡,ENO1和GPI被认为是人类精子抗冻标志物。因此,推测这些蛋白在鸡精子抗冻过程中也发挥着重要作用。综上所述,代谢通路对提升精液抗冻性有重要作用。AQP3、HYOU1等基因以及UBA52、GSK3A、ENO1等蛋白可作为预测精液抗冻性的关键调控因子。更多还原