利用PiggyBac基因编辑技术制备GFP荧光鸡

【作者】 黄靖康； 秦超； 肖福泉； 金明阳； 孟和；

【机构】 上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室；

【摘要】 引言:转基因动物模型在发育生物学研究、基因功能解析及生物反应器研发中均具有重要应用价值。鸡作为一类重要的模式生物与农业经济动物,其基因编辑相关研究一直受到广泛关注。PiggyBac转座子系统作为一种高效的基因递送工具,因具备整合效率高、可携带大片段外源基因且无残留序列等显著优势,在转基因动物制备领域展现出独特的应用潜力。本研究通过PiggyBac转座子技术介导荧光蛋白基因整合至鸡基因组,旨在建立高效、稳定的荧光标记鸡模型,为禽类基因功能研究及转基因技术优化提供有益帮助。材料与方法:构建携带荧光蛋白基因(GFP)的PiggyBac供体质粒(PB-EGFP)及转座酶表达质粒(PB-transposase),其中GFP由CMV启动子驱动表达。将上述质粒转染浦东鸡原始生殖细显微注射技术,将经筛选浦东鸡PGCs注入发育至2.5天的白来航鸡胚背主动脉,注射量为7000～8000个细胞。注射后的鸡胚置于37.8℃、湿度62%的孵化器中孵化,至21天时观察出雏状况。待雏鸡性成熟后,采集其精液并提取DNA,通过PCR扩增GFP基因片段,以验证该基因是否整合至基因组中。结果(1)在注射的白来航鸡胚中,待出雏的雏鸡性成熟后,采集精液并提取DNA,通过PCR扩增GFP基因片段进行检测最终获得2只阳性嵌合体公鸡。(2)上述嵌合体公鸡与野生型白来航母鸡配种后获得F1代荧光鸡5只。选取F1代荧光鸡继续与野生型白来航鸡配种,获得F2代27只,其中荧光鸡26只,后代阳性率达96.3%。(3)荧光观察结果表明,F1代5只荧光鸡及F2代26只荧光鸡的眼部、腿部、皮肤及羽毛根部均可见绿色荧光。PCR鉴定结果证实,所有荧光鸡的基因组中均能扩增出GFP特异性片段(175bp),而阴性雏鸡及对照组中未检测到该片段。(4)追踪观察至6月龄发现,荧光鸡生长状态良好,荧光表达稳定;除产蛋体积略小外,未出现其他明显发育异常。讨论:本研究借助PiggyBac转座子技术,成功制备出稳定表达GFP的转基因荧光鸡。其优势可能源于转座子介导的主动整合机制,与病毒载体相比,PiggyBac系统可避免因病毒序列残留引发的生物安全风险。F1代检测结果证实,外源基因能够通过生殖系稳定传递,这为建立遗传稳定的转基因鸡品系奠定了基础。荧光鸡模型的建立,为禽类基因表达调控、胚胎发育追踪及转基因育种研究提供了可视化工具,尤其在活体监测外源基因的遗传稳定性方面具有应用潜力。后续研究将从以下方面展开:优化转座子载体设计以进一步提高整合效率;探索组织特异性启动子驱动的荧光表达模型,为禽类基因功能研究及靶向育种提供更精准的工具;研究荧光基因在后代中的传递效率,验证其遗传稳定性。更多还原