灵芝三萜高产菌株高效筛选及高分子量多糖定向发酵研究

【作者】 冯杰； 刘艳芳； 郭嘉； 唐晨旻； 唐传红； 颜梦秋； 张劲松；

【机构】 上海市农业科学院食用菌研究所农业部南方食用菌资源利用重点实验室国家食用菌工程技术研究中心国家食用菌加工技术研发分中心上海市农业遗传育种重点开放实验室；

【摘要】 灵芝是我国一种十分珍贵的食药两用真菌。现代大量研究表明,灵芝的内含物如三萜和多糖等具有较好的抗肿瘤和抗氧化等生物活性。自上个世纪五六十年代开始,灵芝液态发酵便开始蓬勃发展,因其培养周期短、培养环境易于控制及其发酵产物稳定等优点,成为当下的研究热点。然而,目前灵芝的菌种差异较大,自然界中获得的菌种液态发酵中使用会出现菌株退化,发酵不稳定的问题,因此迫切需要获得优良菌株。在常压室温等离子体诱变灵芝原始菌株的基础上,通过微生物液滴培养系统对诱变后的菌株分装在独立液滴内进行培养,以高菌丝体干重和高三萜产量为目标对诱变株进行筛选工作。实验结果表明:共筛选出18个诱变株,其中3株诱变株与出发菌株有拮抗现象,对比平板上生长速度发现:YB05生长对数期与G0023基本一致,YB09和YB18生长对数期出现延迟的现象;对比在摇瓶中液态发酵的结果可知3个诱变株YB05和YB18的菌丝体干重高于出发菌株G0023;通过化学法检测发现YB05菌丝体中三萜含量略高于G0023,比对照提高4.56%;从三萜产量上看YB05和YB18的三萜产量分别比对照提高32.10%和15.72%;通过HPLC法检测发现四个菌株的菌丝体中几乎不含有灵芝酸。此外,三个诱变株通过摇瓶传代五次,并对其生长情况和三萜代谢情况进行分析发现三个菌株的性状能够稳定遗传。高稳定性液体菌种最优制作工艺研究发现,平板装液量≥15mL时,菌丝体生长无明显差异;3cm处菌丝体生物量最高为4.86g/L,初级摇瓶培养9天转接,通过人工神经网络和遗传算法优化得葡萄糖14.5g/L、酵母浸粉8.5g/L,生物量和还原糖得率分别提高18.03%和27.41%。不同规模摇瓶中,250mL摇瓶制备的菌种代谢活力高,而50L发酵罐制备的菌种更适合大规模生产。液体菌种培养5天转接最佳。胞内千万级高分子量多糖最优培养基研究表明,葡萄糖和酵母自溶粉为最佳碳氮源,多糖含量随氮源浓度升高而下降。BP神经网络结合遗传算法优化后,多糖含量提高40.8%,最佳配方为无水葡萄糖29.0g/L、酵母自溶粉4.0g/L、七水硫酸镁0.3g/L。胞内千万级高分子量多糖最优发酵研究表明:在最佳培养基下,探究了接种量、通气量、发酵规模、初始葡萄糖浓度等因素对灵芝胞内千万级高分子量多糖的影响。发现接种量0.5g/100mL、通气量1.0vvm时多糖含量最高。不同规模下,250mL摇瓶多糖含量最高,但发酵罐更利于工业化生产。通过调整初始葡萄糖浓度和补料方法,生物量和多糖含量均显著提升。500L发酵罐实验进一步验证了该方法的有效性和稳定性,降低了成本,提高了底物利用率。发酵规模对多糖组成及生物活性影响:探究了不同发酵规模下制备的多糖组分及生物活性。结果显示,多糖主要由葡萄糖构成,且均具抗炎活性。在50μg/mL-1000μg/mL浓度范围内,对Raw264.7细胞释放NO的抑制率与多糖浓度正相关,抑制率最高达39.29%。研究证明了液态发酵可稳定生产灵芝胞内千万级分子量多糖,为工业化生产提供了参考。更多还原