草菇子实体多肽提取工艺优化及保肝功效研究

【作者】 陈炳智； 张芳艺； 陈娟钦； 吴惠华； 邓优锦； 江玉姬；

【机构】 福建农林大学食品科学学院； 福建农林大学菌物研究中心；

【摘要】 草菇Volvariella volvacea在我国的食用菌领域占有十分重要地位,具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖和提高免疫等功效,但关于草菇子实体多肽(Fruiting-body Polypeptides,VVFP)的保肝功效鲜有报道。本研究以草菇子实体为原料,以多肽得率作为评价指标,提取VVFP;采用透析法分离纯化,并对体外抗氧化活性较强的VVFP结构特征进行分析;通过建立急性ALD小鼠模型进行体内动物试验,利用RNA-seq技术、UHPLC-MS/MS技术和16s rDNA高通量测序,探究VVFP对急性酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)小鼠的保护效果与作用机制。研究表明:通过碱性蛋白酶酶解草菇蛋白得到的VVFP最佳工艺为:料液比为1:50,酶解温度为45℃,加酶量为7000 U/g,酶解时间为2.5 h,pH为11。经响应面优化后,多肽得率为67.24%。经分离纯化,筛选出体外抗氧化活性最强VVFP的分子量在1-3 KD之间,其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和羟自由基清除率分别达到99.81%、99.15%和99.34%,铁离子自由基还原能力为1.47。经LC-MS/MS分析鉴定,发现其分子量主要集中在1.5748 KD,氨基酸的测定,可知分离得到VVFP是一种优质蛋白质。动物试验表明VVFP能够显著延长小鼠醉酒时间并缩短醒酒时间,降低肝脏指数;极显著降低血清中甘油三酯、总胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肝脏中丙二醛的含量,并且降低肿瘤坏死因子-α和白介素-6炎症因子水平,同时显著提高肝脏中乙醇脱氢酶、总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。此外,小鼠肝脏与回肠组织病理切片显示不同浓度的VVFP均对ALD具有一定的预防作用。RNA-seq结果表明:与模型组(MK组)相比,中剂量组(M组)有1349个差异基因,其中有453个基因上调,896个基因下调;基因本体(GO)富集分析发现,差异基因主要富集在肌定位、定位的建立、应激反应和免疫系统等生物过程;京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集推测,VVFP可能通过内质网中的蛋白质加工信号通路,影响蛋白质的加工运输和细胞内离子运动机制,缓解酒精对肝细胞的损伤。代谢组学结果表明:与MK组相比,M组的差异代谢物有218个,其中有123个显著上调以及95个显著下调的差异代谢物,这些变化主要与脂质和类脂质分子、有机酸和衍生物方面有关;KEGG富集分析发现,氨基酸的生物合成和甘油磷脂代谢通路在VVFP的保肝作用中发挥重要作用。多组学联合分析揭示,差异基因和差异代谢物共同富集111条KEGG通路,主要是精氨酸和脯氨酸代谢通路等,与Got1、Arg2和Srm等8个显著差异基因和4-胍基丁酸、L-脯氨酸和γ-氨基丁酸显著差异代谢物密切相关。16s rDNA高通量测序结果表明VVFP对ALD模型小鼠肠道菌群结构有影响,主要是影响肠道里的变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和大肠杆菌种(Escherichia_coli)等。综上所述,本研究探究VVFP对酒精诱导的小鼠肝损伤的作用机理,结果为开发基于草菇的功能性食品和提升草菇的利用价提供理论依据。更多还原