Grb10基因低甲基化在父代氰戊菊酯暴露诱发青春期子代抑郁样行为中的作用

【作者】 王涛； 陈会茹； 王博； 孟秀红； 徐德祥；

【机构】 安徽医科大学公共卫生学院；

【摘要】 目的氰戊菊酯(FEN)是一种具有神经发育毒性的农药,本研究旨在评价父代暴露氰戊菊酯对青少年子代抑郁样行为的影响。方法:将6周龄雄性CD-1小鼠随机分为对照组(0 mg/kg)、FEN(2.0 mg/kg)组、FEN(20.0 mg/kg)组,对照组暴露玉米油,灌胃35天后与8周龄雌鼠1∶1合笼,于GD18自然分娩。在出生后35天采用蔗糖偏好实验,鼠尾悬停实验和强迫游泳实验来评价青春期子代抑郁样行为,采用ELISA实验检测子代中脑多巴胺含量,RT-PCR检测子代中脑和胎鼠后脑和TH和Grb10基因mRNA水平,Western blot检测子代中脑和胎鼠后脑和TH蛋白水平,免疫组化实验检测中脑腹侧被盖区(VTA)中TH表达水平;RNA-seq测序筛选胎鼠后脑基因表达;Methy Target测序检测GD14胎鼠后脑和子代精子Grb10基因CpG片段和位点5mC水平;体外实验上,探讨敲低和过表达Grb10基因对中脑多巴胺能神经元细胞MN9D的调控作用,使用丁酸钠分化MN9D细胞以更好模拟细胞功能和生理状态,在含10%胎牛血清和1%(200 U/mL)青霉素/链霉素的EMEM培养基条件下培养MN9D细胞,随后分别使用GRB10 siRNA和GRB10质粒处理MN9D细胞,RT-PCR检测MN9D细胞TH基因mRNA水平,Western blot检测MN9D细胞TH蛋白水平。结果:行为学结果提示父代氰戊菊酯暴露可导致青春期子代出现抑郁样行为。ELISA实验结果表明,仔鼠中脑多巴胺含量降低;RT-PCR结果显示,TH mRNA含量显著降低;Western blot和免疫组化实验结果表明父代氰戊菊酯暴露可降低胎儿和子代中脑TH水平。RNA-seq测序结果显示,Grb10 mRNA和蛋白水平在暴露于氰戊菊酯的胎儿后脑中均减少。有趣的是,在体外实验中,敲低Grb10可降低MN9D细胞TH水平。相反,过表达Grb10则增加TH水平。从机制上讲,Methy-target测序结果提示暴露于氰戊菊酯的胎儿后脑中,Grb10基因在一个CpG片段上的5mC含量减少。而父代精子在暴露于氰戊菊酯后,其Grb10基因在18个CpG位点上的5mC含量也相应减少。结论:父代氰戊菊酯暴露可诱发青春期子代抑郁样行为,父代Grb10基因的低甲基化介导的多巴胺含量降低可能是抑郁样行为的发生原因之一。更多还原