肠球菌穿孔毒素Epx3对鸡巨噬细胞（HD11）的致病作用研究

【作者】 邵颖； 程凡玉； 祁克宗；

【机构】 安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室；

【摘要】 【研究目的】探究Epx3对HD11细胞的毒性作用,阐明其通过线粒体凋亡途径诱导细胞死亡的分子机制,并筛选鉴定Epx3的潜在互作蛋白,为解析肠球菌Epx家族毒素的致病机制提供理论依据。【材料方法】构建p ET28a-epx3原核表达载体,优化诱导条件后纯化重组蛋白,通过CCK-8检测细胞存活率;间接免疫荧光(IFA)观察Epx3亚细胞定位;透射电镜分析线粒体超微结构变化;荧光探针检测线粒体膜电位、活性氧及钙离子水平。基于转录组测序分析差异基因,通过GO和KEGG富集分析关键通路;RT-qPCR和Western blot验证线粒体凋亡通路关键蛋白(Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase-3)的表达变化。构建p GEX-6p-1-epx3载体表达GST-Epx3融合蛋白,联合GST Pull-down和质谱技术筛选。HD11细胞互作蛋白;通过AlphaFold进行蛋白三维建模与分子对接;构建p CMV-3×Flag-PSMD13/CSNK2A1和pCAGGS-HA-epx3真核载体,利用Co-IP验证互作关系。【结果】Epx3(50μg/mL)处理12 h可致HD11细胞死亡率达50%,IFA显示其定位于细胞核及膜周区域;电镜观察显示线粒体肿胀、嵴断裂;ΔΨm显著降低,ROS和Ca2?水平呈剂量依赖性升高,表明Epx3引发线粒体功能障碍。转录组学分析发现3,670个差异基因,富集于NOD/Toll样受体、MAPK、p53及凋亡通路;实验验证Bcl-2表达下调、Bax上调,Cytochrome C释放及Caspase-3激活,证实Epx3通过线粒体途径诱导凋亡。筛选出296个候选互作蛋白,其中凋亡相关蛋白CSNK2A1(酪蛋白激酶2α1)和PSMD13(蛋白酶体调节亚基)通过Co-IP证实与Epx3结合;分子对接显示CSNK2A1与Epx3结合界面稳定。【讨论】本研究揭示Epx3通过破坏线粒体功能、激活ROS-Ca2?-凋亡级联反应导致HD11细胞死亡。Epx3与CSNK2A1的互作提示其可能干扰宿主细胞激酶信号网络,增强致病性。研究结果为理解肠球菌穿孔毒素的跨物种致病机制提供了新视角。更多还原