海湾扇贝Argopecten irrandians转录组测序及热耐受性关联分析

【作者】 杜雪地； 李莉； 张国范；

【机构】 中国科学院海洋研究所； 中国科学院大学；

【摘要】 海湾扇贝(Argopecten irrandians)原产于美国大西洋沿岸及墨西哥湾,可分为4个地理亚种,它们是:A.i.irradians、 A.i.concentricus、 A.i.amplicostatus和A.i.taylorae。其中A.i.irradians (Lamarck,1819)和A.i.concentricus (Say,1822)于二十世纪八十年代和九十年代由张福绥等首次引种至中国(Zhang,He et al.1986;Zhang,He et al.1994),现一直是我国重要的水产养殖贝类。A.i.irradians又称海湾扇贝北方亚种,养殖区主要分布在河北、辽宁和山东沿海;A.i.concentricus又称海湾扇贝南方亚种,养殖区主要分布在雷州半岛沿海及北部湾海域。为在海湾扇贝基因区筛选SNP标记,我们对海湾扇贝北方亚种和南方亚种养殖群体分别进行了转录组测序,其中北方亚种来自河北秦皇岛(20只)、山东莱州(20只)和山东黄岛(20只),南方亚种来自广东湛江(40只)。解剖海湾扇贝取适量的鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺及血细胞,在液氮中研磨成粉末,利用Trizol法提取总RNA(Liu,Zhou et al.2011)。将北方亚种和南方亚种不同个体来源的RNA混匀,交公司进行转录组测序,要求测序量分别为8G和5G。过滤低质量数据后,获得北方亚种约7G数据量,南方亚种约4.3G数据量。将南北亚种所有reads混合,利用Trinity软件进行了组装,后经Tgicl聚类获得海湾扇贝通用unigene序列,统计结果见表1。通过与Nr、SwissPro、IPR数据库比对进行unigene的功能注释,共有31,681条unigene得到注释;通过与GO、COG和KEGG数据库比对,得到了unigene的功能富集注释和代谢通路注释。通过卡方检验,筛选到南北亚种间差异表达基因155个,其中126个基因可以通过同源比对得到注释。在所有差异表达基因中,112个在南方亚种中表达量下调43个在南方亚种中表达量上调,这些差异表达的基因可能与南北亚种间的诸多差异有关。利用SOAPsnp软件进行SNP calling,在北方亚种和南方亚种分别筛选得到10,639,439和7,950,404个SNP,进一步过滤最终得到37,069和29,521个高质量SNP,其中11,132个为南北亚种间共有,25,937个为北方亚种特有,18,389个为南方亚种特有;另有23,647个位点为南北亚种间特有SNP。同时还筛选得到SSR位点2590个。用于关联分析的SNP标记来源于两部分:1)在候选基因内开发的SNP标记(候选基因为HSP、SOD等与维持细胞内稳态相关的基因),2)利用南北亚种共有SNP进行等位基因不平衡分析得到的280个不平衡位点开发的SNP标记。关联分析群体是具有南方亚种和北方亚种遗传来源的F2群体ZZ和ZN,其得来过程是:北方亚种♂×南方亚种♀(20×20)得到杂交贝Z,杂交贝Z♂×杂交贝Z♀(20×20)得到ZZ,杂交贝Z♂×北方贝N♀(20×20)得到ZN。ZZ和ZN在海上养至100日龄,取300只到实验室进行暂养(2天,25±0.5℃),后对其中230只进行逐步升温的热胁迫处理,每天升温0.5℃。暂养及处理期间每天10:00换水并适量投喂。处理期间每天上午9点、下午3点和晚上10点检查扇贝死亡情况,并立即对死亡样本进行酒精固定。选取每个群体最先死亡的48只作为热敏感群体,最后死亡的48只作为热抗性群体,提取DNA并利用HRM方法(Liew,Pryor et al.2004;Seipp,Durtschi et al.2007)检测每只扇贝每个SNP位点的基因型。利用plink软件进行费歇尔确切检验(Purcell,Neale et al.2007),发现ZZ群体中有18个SNP标记与海湾扇贝热耐受性相关,ZN群体中有5个SNP标记与其热耐受性相关,其中1个SNP标记在两个群体中均显示出与海湾扇贝热耐受性相关,同源比对显示该基因为SOD基因,统计结果见表2。结论:首先,海湾扇贝引种至中国后,经过二十多年的养殖仍然保持了较高的多态性,可以提供海湾扇贝养殖产业链持续发展的遗传基础;其次,通过转录组测序,首次大规模获得了海湾扇贝的基因序列和DNA标记,为海湾扇贝的基础研究和分子育种实践提供了资源;最后,运用关联分析的方法对海湾扇贝热耐受性进行了遗传解析,筛查到1个与其热耐受能力相关的SNP标记,针对该基因及上下游基因的深入研究将有助于揭示海湾扇贝南方亚种比北方亚种耐热的分子机制。更多还原