狂犬病病毒GX074株P-M^S20F突变体构建及其生长特性鉴定

【作者】 彭璟； 李文芳； 陆丽莹； 韦显凯； 李晓宁； 罗廷荣；

【机构】 广西大学动物科学技术学院； 亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室；

【摘要】 [目的]探索狂犬病强毒GX074株的P蛋白及其M蛋白第20位苯丙氨酸替换至弱毒株rRC-HL的重组突变体在BSR/T7-9细胞的生长特性,为针对狂犬病病毒P和M蛋白的转录复制机理研究提供理论依据。[方法]运用反向遗传学技术将GX074的M蛋白第20位苯丙氨酸替换到rRC-HL(GX074 P)重组毒株中,构建出rRC-HL(P-MS20F)突变病毒感染性cDNA克隆,并成功拯救病毒。经过多步生长曲线测定、蛋白免疫印迹试验和mRNA转录水平测定,验证P蛋白协同M蛋白第20位氨基酸替换后对RABV生长特性的影响。[结果]经RT-PCR扩增和片段测序,拯救的重组病毒序列与预期一致。多步生长曲线显示,构建的重组突变病毒在24～96h病毒滴度均高于亲本弱毒rRC-HL和对照弱毒株rRC-HL(GX074PM1),为亲本弱毒rRC-HL的10倍。在蛋白转录水平上,GX074株P蛋白氨基酸功能域联合M蛋白第20位苯丙氨酸替换至弱毒rRC-HL株后,增加了突变体病毒的N和M蛋白的表达。在mRNA转录水平上,培养24、48h后,rRC-HL(GX074P-MS20F)株的N、P、M基因相对表达量与亲本毒株和对照弱毒株相比明显上调。结果表明强毒GX074株的M蛋白第20位苯丙氨酸的替换提高了病毒在细胞间的复制和增殖能力,病毒转录能力也明显增强,M蛋白第20位苯丙氨酸可能是影响病毒复制和转录的关键位点。更多还原