LncRNA LOC105378097 inhibits cardiac mitophagy in natural ageing mice

【作者】 刘鑫； 白雪； 刘亨； 洪洋； 崔浩； 王磊； 徐婉晴； 赵立敏； 李笑寒； 李慧敏； 李霞； 陈慧； 孟子裕； 娄涵； 徐恒辉； 林园； 杜智敏； Philipp Kopylov； 杨宝峰； 张勇；

【机构】 哈尔滨医科大学药学院药理学教研室(中国生物医药国家省级重点实验室,心血管研究教育部重点实验室)； 寒地非传染性慢性疾病研究中心,中国医学科学院； 哈尔滨医科大学第二附属医院临床药学研究所； 莫斯科谢切诺夫第一医科大学预防与急诊心内科； 墨尔本大学墨尔本生物医学学院药理学与治疗学教研室,墨尔本牙科与健康科学学院； 黑龙江省医学科学院代谢性疾病研究所；

【摘要】 背景:心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）严重威胁老年人的健康和生活质量,且发病率随年龄增长而增加。年龄的增长导致组织和器官的逐渐退化,导致对压力的脆弱性增强。尽管改善循环系统疾病结果的努力导致死亡率下降,但它们仍然是世界范围内死亡的主要原因1。老龄化是心血管疾病的主要风险因素和治疗负担²,这将对卫生保健系统的成本产生重大影响³。转录组数据显示,<3%的转录组是蛋白质编码基因⁴。其余为编码能力有限的非编码RNA（ncRNAs）,包括microRNAs、transfer RNAs、small nucleolar RNAs and long ncRNAs（lncRNAs or lncRs）^5,6。LncRNAs被定义为长度超过200nt的转录本⁷。LncRNAs的作用机制极其多样,包括转录调控、表观遗传调控和转录后调控⁸。这些功能大多是通过lncRNA与蛋白质结合来发挥作用的,如转录因子、染色质修饰剂和其他功能蛋白。在过去十年中,越来越多的研究表明lncRNAs在发育和疾病（包括衰老和心血管疾病）中的关键作用^9-14。我们之前的研究也发现lncRNA可以直接结合靶蛋白,分别对心肌梗死和心律失常的钙稳态和电传导产生影响^13,15-17。在心血管衰老中,lncRNAs正成为治疗的新前沿^18-20。LncRNAs研究和应用的最大限制是缺乏组织特异性。因此,我们首先在GenBank中筛选了心脏富集的lncRNAs,并检测了它们在衰老过程中的表达。其中,LOC105378097在衰老AC16细胞中表达量最高。LOC105378097的病理生理功能和分子机制尚不清楚。因此,我们进一步研究LOC105378097在心脏衰老中的作用。线粒体在细胞代谢和存活中起重要作用^21,22。线粒体功能障碍和线粒体含量减少与衰老和相关病理生理状况有关²³。受损的线粒体不仅产生过多的活性氧,而且激活细胞死亡途径²⁴。去除受损的线粒体是维持细胞存活和保护细胞免受损伤的关键。线粒体自噬是通过自噬有选择地移除和降解功能失调的线粒体的过程,已被证明在几种心血管疾病中具有保护作用,包括缺血-再灌注²⁵、心力衰竭^26,27和心脏老化²⁸。几项研究表明,自噬增强防止应激和其他损害来源引起的心脏损伤,而自噬功能的障碍导致功能障碍的线粒体积累和组织损伤增加²⁶。已有报道与衰老相关的自噬功能受损²⁹。心脏中自噬的抑制导致与年龄相关的心肌病³⁰。自噬相关基因与蠕虫和苍蝇的寿命有关^31,32。尽管自噬在衰老中的功能作用已被揭示,但随着年龄的增长,线粒体自噬水平下降的上游触发因素仍需进一步研究。在这里,我们利用心脏衰老的体内和体外模型来检测年龄如何影响自噬反应,以及心脏特异的lnc RNA LOC105378097是否是关键控制因素。为方便起见,我们将其命名为SMAL（衰老-自噬相关lncRNA）或lncR-SMAL。方法:用实时定量聚合酶链式反应检测不同年龄人和不同年龄小鼠心脏组织中lncR-SMAL的表达。用超声心动图和压力-容量测量系统评价lncR-SMAL对小鼠心功能的影响。通过苏木素-伊红染色、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术和蛋白质印迹分析衰老相关标记物p53和p21的表达来评价心脏衰老。用Western印迹法、m RFP-GFP-LC3腺病毒颗粒转染法和mito-Keima染色检测心肌细胞线粒体自噬。通过分子对接、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down实验验证lnc R-SMAL和Parkin之间的相互作用。通过泛素化实验探讨Parkin抑制的分子机制。通过电子显微镜检查、JC-1染色和耗氧率分析,检测lncR-SMAL对线粒体功能的影响。结果:我们的数据表明,60岁以上的人血清样本中lncR-SMAL水平显著高于青年对照组,衰老的AC16细胞的胞核和胞浆中lncR-SMAL水平均显著升高。重要的是,这种上调对心脏产生了显著的促进衰老作用。这一发现得到了以下发现的支持:在其他正常的小鼠中,人为过表达lncR-SMAL会造成与自然衰老小鼠相似的心功能损害。此外,lnc R-SMAL减弱了Parkin在自然衰老小鼠中过度表达的抗心脏衰老和促进线粒体自噬的作用。在细胞水平上,lncR-SMAL的过表达促进了心肌细胞的衰老;与此同时,抑制心肌细胞内源性lncR-SMAL部分地阻止了D-gal诱导的细胞衰老、线粒体自噬损伤和功能障碍。此外,经Parkin-KO和BAFA1处理后,si-SMAL对细胞线粒体自噬和衰老的有益作用大大减弱。在分子水平上,lncR-SMAL被发现直接与Parkin蛋白结合并促进其泛素化,导致Parkin蛋白在心肌细胞衰老过程中的不稳定和功能水平的降低。这些发现允许我们提出以下范式,用于在心脏老化的背景下通过lncR-SMAL调节线粒体自噬:心脏老化→lncR-SMAL↑→Parkin↓→线粒体自噬↓→细胞衰老↑→心功能↓。结论:本研究首次证明了一种心脏富集的IncRNA,SMAL,通过下调Parkin蛋白抑制心肌细胞的线粒体自噬,从而进一步促进自然衰老小鼠的心脏老化和心功能障碍。更多还原