马铃薯捕光色素结合蛋白基因StCP24的克隆及其功能研究

【作者】 刘玉霖； 李世伟； 裴雅婷； 唐鑫华； 石瑛；

【机构】 东北农业大学农学院； 寒地粮食作物种质创新与生理生态教育部重点实验室；

【摘要】 马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界四大主粮作物之一,最早发现于南美洲的安第斯山脉,其营养价值高、产量大、适应性强、种植广泛。马铃薯叶片光合作用合成的有机物以蔗糖的形式运输到地下块茎,用于分解供能或储存。光合作用由光反应和暗反应组成,其中光反应须通过光合膜上的一系列色素蛋白复合体之间的相互分工协作完成,关键步骤即光诱导的电荷分离引起的能量转换,这发生在反应中心,而负责吸收太阳能并将其传递到反应中心的就是捕光色素蛋白复合体(Light-harvesting chlorophyll protein complex,LHC)。提高马铃薯光合作用对于提高马铃薯产量尤为重要。马铃薯可以与其他高秆作物间作,但单产会受到生育期内光照强度不足的影响;马铃薯脱毒组培苗繁育生产过程需要消耗大量的能源用作补充光照强度。因此研究马铃薯光合作用机制、挖掘耐弱光基因、利用基因工程技术培育高光效的马铃薯品种,对于提高马铃薯单产和节本增效具有重要作用。实验室前期通过对12个主栽马铃薯品种在生育期遮光处理,分析生长指标、生理指标、光合参数、荧光参数、产量指标差异,初步筛选出马铃薯品种"大西洋"为耐弱光品种、"东农310"为弱光敏感品种。试验对弱光处理下0和48 h的马铃薯品种"大西洋"进行转录组测序,通过对差异表达基因进行KEGG通路富集分析注释得到832条Unigenes。这些差异基因富集的代谢通路有捕光色素结合蛋白、植物激素信号转导、昼夜节律、植物苯丙素合成、淀粉和蔗糖代谢等通路,其中植物激素信号转导中差异基因的数量最多;捕光色素结合蛋白通路中的Rich factor最大,富集程度最高。在差异表达基因中筛选捕光色素结合蛋白相关基因,共筛选到27个差异表达基因,包含26个上调基因和1个下调基因,从27条基因中选取表达量较高的12条捕光色素结合蛋白基因进行q RT-PCR验证和时空表达分析。初步确定马铃薯StCP24为响应弱光胁迫的功能基因,对St CP24进行cDNA全长克隆并将其转入本氏烟草和马铃薯品种"东农310"中,经PCR和qRT-PCR对多个转化株系检验,表明目的基因已整合到受体植株基因组并稳定过量表达。经对转基因烟草光合生理指标的测定初步确定该基因功能。通过在不同光照强度、不同光周期条件下分析马铃薯转基因株系形态指标(叶面积、根长、株高、茎粗、茎重、叶片重、鲜重)、叶片的生理指标(叶绿素a、叶绿素b、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量)、荧光参数(Fv/Fm、 ETR、 ETRmax、 IK、 qp)、光合参数(光合速率、蒸腾速率、气孔导度、细胞间CO2浓度)、基因相对表达量等,进一步明晰StCP24基因功能;通过烟草的瞬时表达明确其表达部位;结合对转基因马铃薯株系转录组测序及qRT-PCR技术验证,分析与其相关的基因。主要试验结果为:(1)捕光色素结合蛋白基因家族在马铃薯中表达存在时空表达特异性。捕光色素结合蛋白基因在叶中相对表达量显著高于茎和根,且基因的相对表达量在弱光处理初期显著升高,随着处理时间的持续总体呈现先升高后降低,但降低后仍显著高于弱光处理启始时的相对表达量。(2)生物信息学分析表明St CP24蛋白为亲水性蛋白,StCP24启动子中包含光响应、防御和应激反应等元件。系统发育分析表明马铃薯中的StCP24与野生种番茄和栽培种番茄中的StCP24亲缘关系最近。烟草亚细胞定位实验表明St CP24基因编码蛋白定位于叶绿体中,与预测结果一致。(3)将St CP24基因转入烟草,其在烟草中过量表达可以增加叶绿素相对含量、提高电子传递效率。初步明确StCP24基因的功能。(4)将StCP24基因转入马铃薯,在不同光照强度和光照周期处理下St CP24基因的过量表达能够增加转基因马铃薯叶片的叶绿素a、 b含量,提高Fv/Fm、 ETR、 ETRmax、 qp,促进植株生长。(5)光合作用光反应中StCP24基因的过量表达会影响暗反应中St PPDK、StPEPC、StFBA1、StFBA3基因的表达。(6)盆栽种植转StCP24基因马铃薯叶片叶绿素含量显著升高、 Fv/Fm、 ETR、 IK、净光合速率、蒸腾速率、气孔导度显著提高,且转基因植株单株产量显著高于野生型。更多还原