茄链格孢AsSod基因致病机制初探

【作者】 李怡璠； 闫成燚； 齐乐丹； 韩冬冰； 陈泽顺； 朱杰华； 赵冬梅；

【机构】 河北农业大学；

【摘要】 马铃薯作为全球四大粮食作物之一,在中国的种植面积逐年扩大,据估计,目前中国马铃薯种植面积接近666.67万hm2,总产量和种植面积均居世界第一。由茄链格孢(Alternaria solani)引起的马铃薯早疫病是影响中国马铃薯生产的重要真菌病害之一,一般情况下造成20%～25%损失,严重时可达70～80%。目前对马铃薯早疫病的防治以化学防治为主,但长期施用化学药剂不仅会造成环境污染、农药残留问题,还会诱导病原菌产生抗药性。因此,探索早疫病菌致病的分子机制,发掘新的杀菌剂靶标,开发新型绿色农药是防治早疫病的有效策略。病原真菌Cu/Zn-Sod作为SOD家族的一员,其在多种真菌病原菌中致病性研究已有很大进展。麦角菌缺失Sod基因的突变株与野生型菌株相比在侵染初期突变株的致病性变弱。死体营养型真菌病原菌灰葡萄孢,缺失BcSod后,显著延缓了豌豆叶片的发病速度,说明BcSod是灰葡萄孢侵染过程中关键的致病因子。核盘菌中,SsSod缺失突变体对其易感寄主豆科植物的毒力降低,表明Ss Sod是核盘菌致病性所必需的。实验室前期研究发现,茄链格孢缺失As Sod基因突变株致病力显著下降。在此基础上,通过对野生型菌株HWC-168和ΔAs Sod突变株侵染结构形成能力、病原菌在寄主中的扩散及侵染马铃薯后植物抗病通路相关基因表达量的变化测定,初步探明茄链格孢As Sod基因的致病机制。在对HWC-168和ΔAs Sod侵染结构形成能力的观测中,通过刮刀损伤、紫外线诱导和变温处理对茄链格孢的野生株HWC-168和突变株ΔAs Sod进行诱导产孢,收集分生孢子,配成104个/m L的分生孢子悬浮液,吸取10μL的分生孢子悬浮液滴加在疏水载玻片的中央,然后将载玻片放进培养皿中28℃黑暗保湿培养, 2、 4、 6、 8 h后分别观察HWC-168和ΔAs Sod侵染结构的形成情况。结果表明, HWC-168的分生孢子培养4 h后开始萌发,在分生孢子边缘产生芽管, 6 h后产生更多的芽管向四周延伸, 8 h后产生芽管数量更多,芽管生长更长。同样,ΔAs Sod在培养4 h后分生孢子开始萌发产生芽管, 6 h和8 h后有更多的芽管产生,但产生的芽管数量明显少于野生型。HWC-168和ΔAs Sod均未观察到附着胞的产生,说明茄链格孢可能以芽管的形成侵染寄主植物,同时As Sod的缺失导致茄链格孢分生孢子产生芽管的数量减少。进一步将HWC-168和ΔAs Sod接种马铃薯叶片,取接种3、 6、 9、 12、 24、 48 h后的叶片材料,经过固定和脱色处理24 h后,用去离子水清洗叶片,之后用1%刚果红染色液和1%苯胺蓝染色液进行染色,再用无菌水冲洗去浮色,在光学显微镜下观察野生株和突变株在对叶片侵染过程中的差别。结果发现HWC-168和ΔAs Sod接种叶片9 h内均未出现病斑。HWC-168接种叶片12 h后,开始出现病斑, 24 h后接种位置叶片变黄褪绿,随着时间的延长病斑不断增大。ΔAs Sod接种叶片48 h后接种处才开始变黄褪绿,同时出现少量病斑。用苯胺蓝和刚果红染色菌丝后,在显微观察下菌丝在叶片中的侵染情况, HWC-168接种3 h后,被侵染的叶片中可以观察到菌丝,接种叶片12 h后,菌丝在叶片中蔓延生长,接种48 h后,菌丝遍布叶片。而ΔAs Sod接种6 h后,被侵染的叶片中才开始出现菌丝,接种12 h后,叶片中仅观察到少量菌丝,接种24 h后,菌丝开始在叶片中蔓延生长,但菌丝蔓延速度较HWC-168慢。接种48 h后,叶片中菌丝的数量明显少于接种HWC-168的叶片,说明由于As Sod的缺失,限制了早疫病菌菌丝在被侵染叶片中的扩展。通过实时荧光定量PCR测定了HWC-168和ΔAs Sod接种马铃薯叶片12、 24、 36、 48、60和72 h后茉莉酸和水杨酸等抗病通路相关基因表达量。结果表明,相较于HWC-168,ΔAs Sod接种叶片后茉莉酸信号通路核心转录因子MTB1基因仅在接种48 h后表达量下调,其余时间均上调表达,并在接种24 h后表达量最高,较HWC-168上调了7.2倍。与野生型相比,水杨酸信号通路关键基因NPR1仅在接种12 h后表达量下调,其与时间表达量均上调,在接种24 h后表达量较野生型上调了9.4倍。与野生型相比,抗病相关基因STH-21在接种36和48 h后表达量上调,较HWC-168上调了2.3倍,在其余时间表达量下调,且在接种60 h后表达量最低,表明As Sod的缺失影响了马铃薯抗病相关通路基因的表达,研究结果将初步探明马铃薯早疫病菌As Sod的致病机制,为挖掘新型杀菌剂作用靶标,发展新的植物病害防控策略提供理论支持。更多还原