马铃薯StNF-YA8基因参与块茎休眠解除的功能研究

【作者】 王霄； 李世贵； 杨江伟； 唐勋； 王泽民； 晋昕； 张宁； 司怀军；

【机构】 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室； 甘肃农业大学农学院； 甘肃农业大学生命科学技术学院；

【摘要】 马铃薯（Solanum tuberosum L.）属茄科茄属,一年生草本植物。其块茎含有丰富的淀粉、蛋白质、维生素等多种营养元素。马铃薯块茎完成后熟阶段之后会转入休眠期,此时块茎所有的芽眼都处于生理休眠状态,给予其适宜的生长条件,块茎也不能发芽。块茎休眠和发芽对于马铃薯栽培、块茎生产和加工都极为重要。在栽培过程中,块茎作为种薯时休眠程度影响着田间出苗的早晚、整齐度和产量的高低,休眠会延长块茎的发芽和生长,最终影响商品薯产量,必要时需通过物理或化学等手段人工打破休眠期以满足播种需要。当块茎作为食品和加工原料时,要求有较长的休眠期,以便运输和贮藏,休眠解除会造成水分和养分大量消耗,以至丧失商品质量和应用价值。核因子Y（Nuclear Factor-Y, NF-Y）又被称为HAP或CBF基因,是真核生物中普遍存在且进化保守的一类转录因子,由于能够结合下游基因启动子区的CCAAT作用元件,又被称为CCAAT结合因子。NF-Y亚基可以分为三大类:NF-YA（HAP2/CBF-B）、 NF-YB（HAP3/CBF-A）和NF-YC（HAP5/CBF-C）。NF-Y有3种作用方式调控下游靶基因的表达。经典的作用模式为NF-YB与NF-YC在细胞质中相互识别并通过HFM结构域发生相互作用,形成NF-YB/C异源二聚体,然后转移到细胞核中,与特定的NF-YA识别并相互作用形成具有活性的异源三聚体。识别靶基因启动子区CCAAT-box与之特异性结合,调控下游基因的表达。第二种作用模式为在细胞质中NF-YB与NF-YC发生初级组装形成NF-YB/C二聚体,再转移到细胞核内与其他因子X形成异源三聚体,识别特定基因启动子区顺式元件进而调控该基因表达。除了三聚体转录调控模式外,有研究发现NF-Y转录因子可以招募去甲基化酶或招募和引导染色质重塑因子影响转录进而对基因座的活性进行调控。大量研究表明, NF-Y转录因子能够参与植物胚胎发育、种子萌发、果实成熟的调控以及响应生物和非生物胁迫过程。试验对StNF-YA家族基因在马铃薯栽培品种"Favorita"块茎不同生长时期表达量进行了定量分析,筛选出了参与块茎休眠解除基因StNF-YA8。采用酵母双杂交、双分子荧光互补、萤火虫素酶互补实验、酵母三杂交、共定位技术鉴定出StNF-YA8与StNF-YB20和StNF-YC5形成三聚体发挥作用。通过生物信息学分析、酵母单杂交、双荧光素酶报告基因实验筛选并鉴定出了该转录因子下游靶基因StGA20ox1、StGA3ox1、St PP2CA1和StCYP707A2。StNF-YA8转基因块茎休眠和发芽特性分析结果表明,StNF-YA8过表达块茎休眠解除时间早于非转基因块茎和抑制表达块茎。为了进一步明确该转录因子在块茎休眠解除过程中参与的生物学功能,分析了转基因和非转基因块茎休眠解除时顶芽处赤霉素（Gibberellic acid, GA）和脱落酸（Abscisic acid, ABA）合成和代谢相关基因的表达量、 GA3和ABA含量以及抗氧化酶活性。结果表明块茎顶芽处StGA20ox1、St GA3ox1、StPP2CA1、StCYP707A2基因表达量均表现为过表达块茎显著高于非转基因块茎和抑制表达块茎（P<0.05）;激素含量分析表明,过表达块茎中GA₃/ABA较非转基因块茎显著升高（P<0.05）,而抑制表达块茎中GA3/ABA显著降低（P<0.05）;对休眠解除时不同块茎顶芽处抗氧化酶活性分析表明,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）在过表达块茎中的活性显著高于非转基因和抑制表达块茎（P<0.05）,而过氧化物酶（Peroxidase, POD）活性则与前两者相反,在抑制表达块茎中的活性显著高于非转基因和过表达块茎中的活性（P<0.05）。综合上述结果表明, StNF-YA8转录因子通过募集St NF-YB20-C5二聚体形成一个复合体,通过调节GA合成基因和ABA分解代谢基因的表达,调节马铃薯块茎中的GA和ABA平衡,促进块茎休眠解除。此外,在块茎休眠解除期间,该复合体也会影响抗氧化酶活性。研究结果可为马铃薯块茎休眠机理研究提供一定的理论基础。更多还原