RSAD2拮抗PDCoV辅助蛋白ns7a发挥内质网应激抑制功能

【作者】 杨宛书； 李娟； 杜柳阳； 顾金燕；

【机构】 浙江大学动物医学中心；

【摘要】 背景:猪丁型冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种在猪群中广泛流行的猪肠道冠状病毒,引起猪群水样腹泻及呕吐,对仔猪具有致死性,给生猪养殖造成了严重的经济损失。PDCoV是目前唯一可在体外培养的δ属冠状病毒,是重要的冠状病毒研究模型,但其复制及致病机制大量未解。我们发现在PDCoV感染的细胞上,干扰素刺激基因编码蛋白RSAD2显著高表达,RSAD2高表达显著抑制PDCoV复制,但具体机制不清楚。研究目的:探究RSAD2抑制PDCoV复制的分子机制。材料和方法:我们利用Co-IP、GST-pull down、激光共聚焦等技术寻找RSAD2的互作病毒蛋白并鉴定其互作关建区域,利用RT-qPCR、Western blot等技术探究RSAD2与病毒蛋白互作的生物学功能及分子机制。结果:我们发现被PDCoV感染的宿主细胞可持续产生大量RSAD2蛋白,且RSAD2显著抑制PDCoV复制。通过Co-IP筛选,我们发现RSAD2可与PDCoV的辅助蛋白ns7及ns7a发生相互作用,GST-pull down验证了RSAD2与ns7及ns7a蛋白均为直接互作。RSAD2与ns7互作的关键结构域为185-362aa,而与ns7a互作的关键结构域为43-362aa。利用激光共聚焦显微镜,我们发现RSAD2与ns7共定位于线粒体,而与ns7a共定位于内质网。通过实验,我们发现病毒蛋白ns7a靶向内质网显著抑制了内质网应激标志物GRP78蛋白的表达水平,降低了未折叠蛋白反应中PERK信号通路的关键分子eIF2α的磷酸化水平及下游效应分子CHOP的蛋白表达水平,证明了ns7a具有内质网应激的抑制功能。进一步研究发现,RSAD2具有拮抗ns7a抑制内质网应激的功能,推测RSAD2可能通过与ns7a互作发挥拮抗ns7a抑制内质网应激的功能,进而抑制PDCoV复制,为解析RSAD2抑制PDCoV复制的分子机制提供了新的理论基础。结论:RSAD2通过与PDCoV辅助蛋白ns7a互作拮抗其发挥抑制宿主细胞内质网应激的生物学功能。更多还原