ε-聚赖氨酸靶标寄主ARF、eIF3e蛋白与TMV互作分子机制研究

【作者】 姜如兰； 安梦楠； 刘鹤； 吴元华；

【机构】 沈阳农业大学植物保护学院；

【摘要】 ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽,已被广泛用作抗微生物药物。关于ε-PL抗植物病毒的研究,前期验证其通过诱导应激反应基因来影响内质网的稳态,从而抑制病毒感染。近年来,药物-靶标蛋白的识别和作用机理的研究常以植物外壳蛋白为靶标,通过小分子化合物与病毒外壳蛋白的互作情况进行验证。前期结果表明,抗植物病毒药剂可能直接作用于病毒外壳蛋白,从而破坏病毒体结构或抑制病毒运动等。本研究旨在明确微生物代谢产物ε-PL靶标寄主蛋白,验证药物与蛋白的互作结合能力。利用VIGS技术对响应药剂调控的蛋白进行抗病毒功能验证。将药物靶标蛋白与病毒分子进行互作研究,除验证药剂可直接作用于病毒蛋白外,还可通过靶标植物蛋白进而影响病毒的复制等功能。本研究前期基于活性蛋白质谱技术提取了ε-PL靶标的植物蛋白,并利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定出64种寄主蛋白。通过对靶标蛋白进行功能注释分析,本研究筛选出2种可能与病毒复制或侵染相关的寄主蛋白——ADP-ribosylation factor (ARF)和Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E (eIF3e)。ARF是大分子的多方面修饰,在抗病毒防御以及微生物代谢、致病性和固氮方面起到一定作用。真核翻译起始因子eIF3e是一种大型蛋白质复合物,与mRNA相互作用,以促进病毒蛋白的翻译。为了明确ε-PL与寄主靶标蛋白的具体结合情况,我们利用微量热泳动技术(MST)对带有GFP标签的蛋白和ε-PL进行互作验证。结果表明,ε-PL对ARF、eIF3e蛋白的对接自由能分别为-4.5kcal/mol和-4.6kcal/mol,可形成较为稳定的蛋白-配体复合物。同时为了明确ε-PL与寄主靶标蛋白的具体虚拟结合位点,本研究利用Autodock分子对接进行研究。以靶标蛋白作为生物大分子,以ε-PL作为配体进行对接。结果表明,ε-PL与ARF在ASP97号位、GLU96号位、GLU98号位相结合;与eIF3e在LEU19号位、ASN66号位、VAL199号位和ASP201号位相结合。同时为验证响应ε-PL处理的寄主靶标蛋白在病毒侵染过程中的功能,本研究利用基于烟草脆裂病毒(TRV)的病毒诱导基因沉默(VIGS)方法进行研究。结果显示,VIGS对ARF和eIF3e基因的沉默效率分别为56%和82%。接种烟草花叶病毒(TMV)后,靶标蛋白的基因沉默的本氏烟顶部叶片表现出比未沉默的本氏烟更轻的感病症状。RT-qPCR及Northern blot结果显示,靶标蛋白基因沉默植株中病毒的积累量显著低于pTRV-GFP浸润的对照植物,分别减少了53%和79%。结果表明,以上寄主靶标基因在ε-PL介导的抗病毒反应中具有重要作用,可能参与了病毒复制等重要过程。最后本研究利用酵母双杂交技术对筛选到的寄主蛋白ARF和eIF3e与TMV相关蛋白进行互作验证,病毒蛋白分别是CP、HEL、MET、MP、P57。结果表明,ARF与TMV的CP和P57蛋白互作,与TMV-HEL和TMV-MP没有明显互作;eIF3e与TMV的HEL和MET蛋白互作明显。综上,本研究结果不仅对抗菌肽ε-PL抗病毒作用机制研究提供理论基础,也为植物病害防控和药物开发提供新的理论和实践指导。更多还原