Rhizoctonia solani AG-3 TB糖苷水解酶GH1基因作为跨界RNA干扰靶标的研究

【作者】 丁晓杰； 刘鹤； 安梦楠； 张崇； 周如军； 吴元华；

【机构】 沈阳农业大学植物保护学院；

【摘要】 由Rhizoctonia solani AG-3 TB引起的烟草靶斑病是一种严重的烟草叶部病害。病菌侵染叶片后,可使叶病斑中心的坏死部分脱落,形成穿孔,影响烟草的生长发育,造成严重的经济损失。近年来,利用RNA干扰原理进行植物病虫害的防治因其靶标特异性高、不易产生抗药性、绿色无残留等优势成为人们致力研发的新技术。而靶标基因是影响RNAi效率的关键因素之一。本研究基于实验室前期转录组学结果,选择了8个在R.solani AG-3 TB侵染植株后上调表达的基因作为候选靶基因:分别为DUF3129家族蛋白(RsDUF3129)、分支酸合成酶(RsCS)、糖苷水解酶家族1 (RsGH1)、多糖裂解酶(RsPLs)、多糖脱乙酰酶(RsPDA)、果胶酶(RsPg2)、谷胱甘肽S转移酶(RsGST)和60 S核糖体蛋白酶(Rs60sR)基因。利用以上8个基因的保守片段构建TRV-HIGS表达载体,农杆菌浸润本氏烟14 d后在系统叶接种病原菌,48 h后测量病斑大小。结果发现:与阴性对照TRV-GFP相比,8个TRV-HIGS植株均不同程度地提高了对病原菌的抗性,其中TRV-RsGH1植株抗病效果显著,病斑抑制率为63.6%,真菌生物量降低了76.8%;RT-qPCR检测RsGH1的表达水平发现,与对照相比其基因表达量降低了64.3%,说明TRV-RsGH1成功地沉默了RsGH1,进而实现了对病害的防控。基于TRV-HIGS的结果,以RsGH1片段为模板体外合成了dsRNA-RsGH1,并测定了dsRNA-RsGH1对病原菌的影响,用浓度为200 ng/mL的dsRNA-RsGH1处理菌丝24h后发现,菌丝的生长速度没有受到明显的抑制,但其菌丝形态出现异常特征。dsRNA-RsGH1处理后的菌丝在生长连接处明显抑缩;新生长的菌丝其形态也发生了严重的变形,呈卷曲状。进一步进行菌丝融合试验发现,dsRNA-GFP处理后的菌丝能正常与R.solani AG-3 TB标准菌株发生菌丝融合现象,而经dsRNA-RsGH1处理过菌丝却不能与标准菌株发生菌丝融合。在普通烟K326的叶片上外源喷施dsRNA-RsGH1后接种R.solani AG-3 TB,接种病原菌48 h后,dsRNA-RsGH1对病斑的抑制率为54.5%;在接种病原菌72 h后,其对病斑的抑制率为43.3%,说明dsRNA-RsGH1对烟草靶斑病的抑制具有时间依赖性。综上,本研究证明了RsGH1可以作为运用HIGS和SIGS技术防治烟草靶斑病的关键靶标,同时研究结果也为RNA生物农药的研发提供了重要理论依据。更多还原