cIGF1R编码的C-IGF1R作为分子开关抑制非小细胞肺癌中耐药持续性肿瘤细胞的线粒体自噬

【作者】 王辉； 董高超； 蒋峰；

【机构】 江苏省肿瘤医院；

【摘要】 目的:EGFR-TKI(酪氨酸激酶抑制剂)是晚期EGFR突变的NSCLC(非小细胞肺癌)患者的一线治疗方案。然而,获得性耐药是不可避免的,这极大地限制了EGFR-TKI的临床应用。为了进一步提高疗效,以EGFR-TKI为基础的联合治疗已成为更好的选择。我们假设在EGFR初始治疗下恢复失调的circRNA能够增强其有效性。因此,我们旨在找出与EGFR-TKI协同增效的circRNA分子,并探究其分子机制以及临床应用前景。材料和方法:通过circRNA测序找出在EGFR-TKI初始用药后表达失调的circRNA分子;通过高通量体内筛选出可以有效协同EGFR-TKI的circRNA-cIGF1R;通过体外和体内功能实验验证cIGF1R本身的功能以及其与EGFR-TKI的协同效果;通过WB,PCR等实验验证其对亲本基因IGF1R的表达的影响;通过RNA下拉实验,银染,质谱检测,免疫荧光和计算机分子对接模拟等实验寻找并验证与cIGF1R相互作用的剪切因子RHA;通过荧光素酶报告基因实验,RIP和公共数据库验证等验证cIGF1R以及RHA对于IGF1R可变剪切的影响;通过短期和长期的平板培养,3-D培养以及体内实验等比较cIGF1R或IGF1Ri与EGFR-TKI联用的短期和长期疗效差别;通过RNA测序、细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和细胞自噬等检测探究cIGF1R或IGF1Ri与EGFR-TKI联用差异的分子机制;通过CRISPR-cas9构建IGF1R敲除细胞系探索cIGF1R协同EGFR-TKI的其他机制;通过核糖体离心、质谱检测以及构建特异性抗体、线粒体自噬相关实验等检测C-IGF1R的表达并探索其分子机制;最后通过构建TET-ON的cIGF1R过表达载体并进行皮下和肺原位种植的小鼠模型探索cIGF1R的临床应用。结果:CircRNA-cIGF1R在经过EGFR-TKI初始治疗后显著低表达。同时过表达cIGF1R在体外和体内均可以有效的协同EGFR-TKI,增加其疗效。cIGF1R与RHA相互作用,竞争性抑制IGF1R m RNA剪接,负向调节亲本基因IGF1R信号通路。这种调控与IGF1Ri相似,诱导肿瘤细胞的DTP状态,同时激活线粒体自噬。cIGF1R还编码一种蛋白C-IGF1R,C-IGF1R可减少Parkin介导的VDAC1泛素化,抑制DTP细胞的线粒体自噬,作为促进DTP向凋亡转变的分子开关。联合cIGF1R的治疗方案可以显著提高小鼠生存,具有一定的临床应用前景。结论:我们的研究结果表明,cIGF1R联合用药可显著提高EGFR-TKIs体外和体内的疗效。这些数据支持探索EGFR-TKI联合cIGF1R作为提高EGFR突变NSCLC患者初始缓解率和扩大获益的策略。更多还原