非核糖体环脂肽brevicidine抗大肠杆菌的作用机制研究

【作者】 钟欣益； 赵兴洪； 殷中琼；

【机构】 四川农业大学动物医学院天然药物研究中心；

【摘要】 [目的]本试验旨在探究非核糖体环脂肽brevicidine对大肠杆菌的抗菌机制。[方法]首先通过微量肉汤稀释法测定brevicidine对大肠杆菌CVCC3749的最小抑菌浓度,并通过平板计数测定其杀菌曲线;通过扫描电镜观察brevicidine对大肠杆菌形态的影响;使用荧光探针氮苯基-1-萘胺（N-Phenyl-l-Napthylamine,NPN）、碘化丙啶（propidiumiodide,PI）、DiSC3（5）、刃天青以及增强型ATP检测试剂盒和活性氧检测试剂盒,检测brevicidine对大肠杆菌CVCC3749细胞膜通透性、膜电位、NADH含量、ATP和活性氧水平的影响;最后,测定了brevicidine与不同浓度的革兰氏阴性菌膜脂成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol,PG）、心磷脂（cardiolipin,CL）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolamine,PE）混合后的MIC值,并通过等温量热滴定仪测定其与LPS、PG、CL的结合常数,测定了其靶点亲和力。[结果] Brevicidine对大肠杆菌CVCC3749 MIC为1μM,且1、2、4 MIC brevicidine在4h内,能够快速杀死大肠杆菌CVCC3749;经1 MIC brevicidine处理15 min的大肠杆菌形态不规则且有不同程度的皱缩,处理120 min后,大部分大肠杆菌被裂解;0.5、1、2 MIC brevicidine处理对大肠杆菌CVCC3749细胞膜通透性无影响,值得注意的是处理后细胞膜电位水平升高、NADH含量升高、ATP水平下降、活性氧水平升高,且呈剂量效应关系;brevicidine与0-128μg/mL LPS、PG、CL混合后,MIC呈随化合物浓度呈剂量依赖性增加,而与128μg/mL PE混合后其MIC保持不变;同时,brevicidine与LPS、CL和PG的结合常数kD值分别为1.79*10^-6、1.56*10^-7和1.70*10^-7mol/L。[讨论]抗生素耐药危机日趋严峻,迫切需要开发具有新型作用机制的抗生素用于兽医临床。LPS、PE、PG和CL是革兰氏阴性菌细胞被膜的主要成分,是筛选新抗生素的潜在靶点^[1],其中,brevicidine的作用靶点PG和CL与细胞形状和呼吸链密切相关^[2],本研究结果表明,brevicidine可与LPS、PG、CL结合,具有多个作用靶点的特性,有利于遏制细菌耐药性的产生,对细菌耐药性防控具有重要意义。[结论] Brevicidine通过与革兰氏阴性菌细胞被膜成分LPS、PG、CL相互作用,耗散其质子动力,抑制NADH脱氢和ATP合成,并导致活性氧累积,从而发挥其良好的抗革兰氏阴性菌活性。更多还原