单核细胞增生李斯特菌XYSN新毒力相关基因筛选及功能研究

【作者】 金繁鑫； 蔡雪薛； 焦新安； 殷月兰；

【机构】 扬州大学人兽共患病重点实验室；

【摘要】 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）为革兰氏阳性兼性胞内病原菌,广泛存在于自然界中。Lm通过污染的食物引起人畜李斯特菌病,主要表现为胃肠炎、脑膜炎、败血症以及流产等,致死率高达20%-30%,被世界卫生组织（WHO）列为必检的食源性病原菌之一。超强毒力Lm XYSN属于新的遗传进化亚谱系HSL-Ⅱ,并定义为新的血清型4h。在口服感染小鼠实验中,其毒力远远高于国际标准强毒株EGD-e,因此挖掘LmXYSN高致病性的相关基因,对于揭示Lm的致病机理和预防李斯特菌病的爆发具有重要的意义。在诸多的分子遗传学研究方法中,转座子可以通过诱导转座元件的随机插入,在短时间内获得大量的用于致病菌表型与基因功能研究的基因插入失活的突变株。本研究通过利用Mariner家族中的TnYLB-1转座元件构建了含有6000个Lm XYSN突变子的转座突变库,从中随机挑取1127个突变子,使用人结肠癌上皮细胞系Caco-2 BBe建立突变子筛选模型以进行与毒力相关基因的筛选,共获得增殖能力下降5倍以上的突变株15株,其中3株突变株的增殖能力降低20倍以上。利用反向PCR和测序对3株突变株的插入位点进行了分析与鉴定,它们的转座插入位点分别位于LMxysn₀462、LMxysn₁095以及LMxysn₁098中。其中LMxysn₀462是已知的在感染非吞噬细胞中发挥重要作用的内化素基因inlA,由此证明本研究采用的细胞模型筛选Lm XYSN毒力因子方法的可行性。测定XYSN₁095::Tn和XYSN₁098::Tn的生长曲线,结果显示基因的插入失活并不影响细菌的生长。通过扫描电镜对细菌形态进行观察发现,XYSN₁095::Tn和XYSN₁098::Tn的菌体变短且部分菌体发生弯曲。对Caco-2 BBe的黏附、侵袭、增殖能力进行测定,结果表明,LMxysn₁095和LMxysn₁098基因的失活极显著地降低了细菌的侵袭与增殖能力。同时,对XYSN₁095::Tn以及XYSN₁098::Tn口服感染BABL/c小鼠LD50测定结果显示,XYSN₁095::Tn的毒力（LD50=1010.24 CFU）比Lm XYSN （LD50=105.08 CFU）降低了105.16倍;且XYSN₁098::Tn的毒力（LD50>2×1010.6CFU）比野生株降低了105倍以上,由此提示LMxysn₁095和LMxysn₁098是Lm XYSN的重要毒力相关基因,在其感染与致病中发挥着重要作用。更多还原