布鲁氏菌Irr蛋白的表达纯化及功能分析

【作者】 孙天浩； 王震； 陈创夫；

【机构】 石河子大学动物科技学院； 西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心；

【摘要】 为了获得高效表达纯化且抗原性较好的布鲁氏菌Irr蛋白,建立以Irr蛋白为诊断靶标的间接ELISA法检测布鲁氏菌病。通过生物信息学对布鲁氏菌Irr蛋白的理化性质,结构模型,亚细胞定位,抗原表位以及蛋白修饰位点等进行预测分析;合成irr基因并对其进行PCR扩增验证,将验证正确的基因连接至表达载体pCzn1,进行诱导表达并纯化蛋白;通过Western blot分析验证该蛋白的免疫学特性;以Irr蛋白作为包被抗原,采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了筛选。结果表明,该蛋白属于Fur家族,无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主,并且成功的构建了该蛋白的三维模型。该蛋白有6个B细胞抗原表位及3个T细胞抗原表位,无乙酰化修饰位点,有7个苏氨酸磷酸化修饰位点、8个丝氨酸磷酸化修饰位点以及45个甲基化修饰位点。构建了pCzn1-Irr重组蛋白,成功诱导表达并纯化相应蛋白,大小为16.3ku。通过Western blot分析验证该蛋白的反应原性较强。建立间接ELISA法检测该蛋白最优条件下P/N为3.09。综上所述,本试验通过对Irr蛋白的结构和功能进行生物信息学预测分析,为Irr蛋白作为诊断靶标提供理论依据,同时成功构建了irr基因的原核表达载体,表达并纯化Irr蛋白。所表达蛋白具有良好的抗原性,该蛋白具有诊断蛋白的潜力,建立了初步的间接ELISA方法,为布鲁氏菌病的早期诊断和流行病学调查提供了必要手段。更多还原