TaqMan荧光定量PCR检测混合感染和生物被膜中的猪链球菌和副猪嗜血杆菌

【作者】 靳曼玉； 李金朋； 东笑； 毛晨龙； 高梦霞； 樊浩然； 樊擎莹； 张小玲； 李小康； 丁轲； 汪洋；

【机构】 河南科技大学动物科技学院,洛阳市畜禽分子病原与免疫学重点实验室；

【摘要】 呼吸道感染是严重影响世界养猪业的疾病。猪链球菌(Streptococcus suis,SS)和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是两种重要的猪呼吸道常在菌和致病菌。在临床实践中,经常发生猪链球菌和副猪嗜血杆菌在呼吸道的混合感染。作为引起猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的两种重要致病菌,猪链球菌和副猪嗜血杆菌的混合感染加强了病原体对机体的损伤,提高了猪呼吸道疾病综合征的发病率和死亡率。同时,猪链球菌和副猪嗜血杆菌形成的混合生物被膜不仅会导致持续感染,而且会增加细菌的耐药性。TaqMan荧光定量PCR是一种功能强大、易于使用的高通量技术,具有高度的特异性,克服了传统普通PCR检测方法的局限性。为了更准确、快速地检测猪链球菌和副猪嗜血杆菌,本研究通过对猪链球菌和副猪嗜血杆菌在NCBI中登录的保守基因序列设计特异性引物与TaqMan探针,首次建立了一种用于可以同时定量检测这两种病原菌的TaqMan荧光定量PCR方法。分别以猪链球菌gdh基因和副猪嗜血杆菌16S rRNA基因重组质粒建立标准曲线,评价此方法的特异性、敏感性和重复性。猪链球菌和副猪嗜血杆菌的扩增效率分别为95.9%和113.6%,R~2均大于0.99。猪链球菌和副猪嗜血杆菌细胞丰度标准曲线的斜率分别为1.05和1.22,R~2均为0.98。分别将10~8 cfu的浮游态猪链球菌和副猪嗜血杆菌添加到混合生物被膜中,测定每个生物被膜上的细菌数量约为10~8 cfu。结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对混合生物被膜中猪链球菌和副猪嗜血杆菌的检测具有特异性和准确性。本研究建立的方法有助于猪链球菌和副猪嗜血杆菌混合感染引起的疾病的检测、预防和控制。更多还原