牛let-7a靶向调控IL-6的分子机制研究

【作者】 陈伶慧； 申祥； 徐萍； 张文婷； 张晓建；

【机构】 河南科技学院动物科技学院；

【摘要】 IL-6参与乳腺炎症疾病的免疫应答,并对乳腺上皮细胞有调节作用。IL-6基因受miRNA调控,进而影响乳腺炎发生发展进程。为了研究let-7a及其靶基因IL-6对MAC-T细胞的分子调控机制。本文采用生物信息学软件预测let-7a可能靶向调控IL-6基因,利用双荧光素酶报告载体构建、RT-qPCR和ELISA等方法,研究let-7a在MAC-T细胞中对靶基因IL-6的调控作用;通过合成let-7a的mimic和inhibitor分别转染MAC-T细胞,研究其在MAC-T细胞中的调控作用。试验结果表明,(1)生物信息学软件结果显示IL-6的3’UTR区与let-7a存在靶向结合位点;(2)通过PCR分别对IL-6和let-7a扩增,结果显示目的条带单一,条带清晰,且大小与预期的一致。将目的片段与PMIR和PEZX载体连接,转化后得到重组质粒PMIR-IL-6-3’UTR和PEZX-let-7a,重组质粒分别采用菌液PCR鉴定、双酶切和测序进行鉴定,结果与NCBI中let-7a和IL-6序列同源性为100%。(3)双荧光素酶活性分析显示,let-7a能与IL-6 3’-UTR的靶标位点特异位点结合。为验证双荧光素酶的结果,对let-7a调控的差异表达靶基因IL-6进行qRT-PCR验证,以GAPDH为内参。在乳腺上皮细胞(MAC-T)中转染let-7amimic、let-7a inhibitor以及negative control (NC)后,与对照组相比,转染let-7a mimic后引起乳腺上皮细胞中IL-6的基因的mRNA的表达量显著降低(P<0.01);抑制let-7a表达后,引起乳腺上皮细胞中IL-6的基因的mRNA的表达量显著升高(P<0.01),与双荧光素酶验证结果一致。(4)ELISA检测转染let-7a mimics、inhibitor和NC对照48h后MAC-T中IL-6蛋白表达。结果表明,与NC相比,MAC-T中let-7a的过度表达显著降低了IL-6的蛋白水平(P<0.05)。相反,let-7a的下调导致IL-6的蛋白表达显著增加(P<0.01),即let-7a能够抑制IL-6蛋白水平的表达。综上可以得出,let-7a可以直接靶向IL-6基因,乳腺上皮细胞中let-7a的表达量的上升会抑制IL-6的表达。上述研究结果为进一步研究let-7a在乳腺炎发病过程中的功能研究提供依据。更多还原