非洲猪瘟多重实时荧光定量PCR方法的建立

【作者】 刘娜； 矫健； 孙文博； 房立春； 郭立辉； 张琳； 于江； 吴家强；

【机构】 山东省农业科学院畜牧兽医研究所； 山东师范大学； 山东省农业科学院家禽研究所；

【摘要】 本研究旨在建立一种准确、快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与基因缺失株的方法。试验根据非洲猪瘟基因序列(No.MK333180.1)分别设计了3对特异性引物和Taqman探针,通过优化退火温度、引物及探针比例,建立了一种ASFV多重荧光定量RT-PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏度、重复性。结果显示,建立的鉴别检测方法在10~0-10~9拷贝/ul模板范围内有良好的线性关系,能够对ASFV的p72、CD2v、MGF三种基因出现阳性扩增信号,但对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增。批内及批间试验变异系数均小于2.5%,说明具有良好的重复性。分别以人工合成的ASFV p72基因,CD2V基因,MGF基因重组质粒为阳性标准品,对ASFV中p72、CD2v、MGF的最低检测模板浓度分别为10~0拷贝/ul、10~2拷贝/ul、10~1拷贝/ul。以P72重组质粒的阳性标准品作为检测样品用五种市面上已有的ASFV单重(p72)检测试剂盒进行检测。其结果显示MGC-qPCR、XSK-qPCR试剂盒能检测到10~0拷贝/ul;YYH-qPCR、TGS-qPCR试剂盒能检测到10~1拷贝/ul;MTD-qPCR试剂盒能检测到10~2拷贝/ul。新建立的多重荧光定量检测方法P72基因的灵敏度等于或高于其他试剂盒,并且此方法还可以通过检测CD2v基因和MGF基因来鉴别ASFV是否为基因缺失株。用该方法对20份环境样品进行了ASFV多重检测,并与其余五种试剂盒进行比较,结果显示20份环境样品中有4份阳性,其余五种试剂盒检测结果相同,且阳性样品的CT值具有良好的相关性。但当样品中的核酸含量较低时,不同试剂盒的检测结果不同。新建立的多重荧光定量检测方法阳性检出率高,其次是MGC-qPCR试剂盒,再之后是XSK-qPCR试剂盒。本研究成功建立了鉴别ASFV野毒株与基因缺失株的多重荧光定量PCR方法,为临床上ASFV CD2v缺失株或CD2v、MGF双缺失株的确定提供更快捷、有效的鉴别手段。更多还原