抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

【作者】 王召阳； 蒋亚君； 刘雪婷； 林伟东； 鑫婷； 郭晓宇； 朱鸿飞； 贾红；

【机构】 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所；

【摘要】 为了构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,并对纳米抗体库进行筛选,获得抗犬瘟热病毒的VHH抗体。利用犬瘟热病毒免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段双酶切后,连接至pCANTAB 5E噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,转化菌株复苏后,梯度稀释,并涂布平板,计算阳性克隆数,挑选4个阳性单克隆,提取质粒后,进行测序验证,计算抗体库库容,加入辅助噬菌粒拯救获得噬菌体展示抗体库。经过三轮淘选,富集对犬瘟热病毒结合力高的噬菌体,富集效果通过ELISA鉴定。选择两株结合力高的噬菌体,利用毕赤酵母系统表达,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1:25 000,达到建库要求,构建噬菌体展示文库,库容量大4×10~9 pfu,阳性率高。进过三轮淘选后,特异性结合犬瘟热病毒的噬菌体得到明显的富集,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性。选取两株特异性纳米抗体进行表达纯化后,ELISA结果表明两株纳米抗体与CDV的反应性显著高于阴性对照(P<0.05)。以上结果提示本研究成功筛选出2株特异性结合犬瘟热病毒较好的VHH抗体,为进一步VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。更多还原