利用CRISPR/Cas9技术构建表达EGFP重组小鹅瘟病毒rGPV-EGFP

【作者】 吉李飞； 唐浩洋； 姜煜晨； 谢泉； 邵红霞； 叶建强； 秦爱建；

【机构】 扬州大学兽医学院教育部禽类预防医学省部共建重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室农业部禽用生物制剂创制重点实验室； 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心； 扬州大学农业科技发展研究院； 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室；

【摘要】 由小鹅瘟病毒(GPV)引起的小鹅瘟是严重影响养鹅业发展的重要传染病。小鹅瘟重在预防,疫苗免疫在小鹅瘟的防控中具有重要作用。本研究在获得GPV细胞适应弱毒株CZM-142的基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,靶向CZM-142毒株的NS基因序列,通过构建特异性gRNA及含EGFP基因的同源臂,在鹅胚成纤维细胞转染gRNA与同源臂质粒以及感染CZM-142细胞适应GPV下进行表达EGFP的重组GPV病毒拯救。在细胞转染后72 h,利用倒置荧光显微镜观察发现,在转染特异性gRNA与含EGFP基因的同源臂质粒及感染CZM-142细胞适应GPV毒的细胞中可见较多表达EGFP的细胞,而在仅转染特异性gRNA与含EGFP基因的同源臂质粒(没有感染CZM-142细胞适应GPV毒)的细胞中未见特异性免疫荧光。这一结果表明,我们已经成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向NS基因获得了表达EGFP的重组GPV病毒rGPV-EGFP。表达EGFP的重组GPV病毒rGPV-EGFP的获得不仅为进一步探究GPV生物学特性、中和抗体检测及抗病毒药物筛选提供了有效标记病毒,而且表明GPV的NS基因可作为外源基因插入位点创制GPV疫苗载体用于联合防控小鹅瘟及其它鹅病病原。更多还原