PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【作者】 邝燕齐； 莫梅君； 何红玲； 周金柱； 周如月； 郭霄峰；

【机构】 华南农业大学兽医学院； 江苏省农业科学院兽医研究所；

【摘要】 [目的]制备猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光(IFA)方法。[方法]以重组表达的PEDVN蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDVN蛋白的单克隆抗体为一抗,荧光素FITC标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,建立PEDV的IFA检测方法。[结果]ELISA、Western Blot和间接免疫荧光鉴定结果表明,制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清的ELISA抗体效价1:3200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1:1000000以上。将单克隆抗体应用在IFA时,最适条件为:80%丙酮-20℃固定30min;一抗1:1000稀释,4℃过夜孵育;二抗1:100稀释,37℃孵育1h。以建立的IFA方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪高致病性蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒、猪肠道α冠状病毒、猪轮状病毒均为阴性,表明以抗PEDVN蛋白单克隆抗体为一抗建立的检测PEDV IFA方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。更多还原