弓形虫顶质体tRNA硫醇化修饰蛋白酶的鉴定和功能研究

【作者】 阳毅敏； 林蜜； 陈璐璐； 潘灵韬； 陈学秋； 杜爱芳；

【机构】 浙江大学动物科学学院,动物预防医学研究所；

【摘要】 转运RNA (tRNA)的S2U34修饰在蛋白质翻译调控中具有重要作用,但弓形虫中尚未有相关报道。本研究拟分析预测弓形虫中可能发挥S2U34功能的蛋白并绘制进化树;通过CRISPR/CAS9技术构建内源性标记虫株,并利用IFA实验明确其蛋白定位;构建基因缺失株并分析目的基因缺失对弓形虫体外生长的影响;利用IFA探究该基因的缺失对弓形虫顶质体生物发生的影响,并通过实时荧光定量PCR分析顶质体自身编码的基因转录表达的变化;最后利用小鼠实验明确其对弓形虫毒力的影响。预测可能有3个基因参与弓形虫tRNA的S2U34修饰,成功构建了3个基因的内源性标记虫株,通过IFA试验发现Tg309110定位于弓形虫顶质体;进化树分析发现其与细菌MnmA (5-甲基氨甲基-2-硫尿苷-甲基转移酶)同源性较高,故将其命名为TgMnmA;缺失TgMnmA后,弓形虫体外增殖变慢,虫斑面积变小;进一步发现TgMnmA基因的缺失会导致部分弓形虫顶质体的异常,同时利用实时荧光定量PCR明确TgMnmA缺失会影响顶质体自身编码基因的转录和表达;最后通过小鼠存活试验发现TgMnmA的缺失会导致弓形虫毒力的明显减弱。实验结果为深入研究弓形虫顶质体tRNA的2-硫醇化修饰奠定了基础,也为弓形虫病的防控提供了重要的理论依据。更多还原