毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的克隆表达与抗原性分析

【作者】 叶状； 王乐乐； 汪飞燕； 刘悦； 许金俊； 候照峰； 陶建平； 刘丹丹；

【机构】 扬州大学兽医学院； 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心；

【摘要】 鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳球虫(Eimeriaspp.)引起的一种寄生于鸡小肠或盲肠黏膜内的寄生性原虫病,严重危害养鸡业。OXIO (Oxioreductase)为具备催化电子转移功能的一系列氧化还原酶的总称,研究显示其亚型OXIO1参与了CH-OH基团释放氢离子的氧化还原反应,从而参与了球虫卵囊壁的形成。本研究以毒害艾美耳球虫(E.necatrix)成壁体和卵囊壁内差异表达的OXIO1蛋白为研究对象,首先在经嗉囊接种卵囊153 h后的鸡盲肠黏膜组织中分离配子体,采用Percoll密度梯度离心法纯化配子体,接着,提取毒害艾美耳球虫配子体总RNA,应用RT-PCR法获取EnOXIO1基因序列,克隆至pGEM-T-Easy载体中测序和序列分析,构建原核表达质粒pET28a(+)-EnOXIO1,转化至BL21 (DE3),IPTG体外诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot鉴定。His标签镊柱纯化重组蛋白,常规免疫BALB/c小鼠,Western-blot分析重组蛋白rEnOXIO1的反应原性。结果显示,OXIO1基因全长为2535 bp,为一个完整的开放阅读框,编码844个氨基酸,等电点(PI)为5.917,与GenBank收录的毒害艾美耳球虫Houghton株的此核苷酸序列同源性为99.6%,显示该基因十分保守。rEnOXIO1主要以包涵体的形式存在,其融合蛋白大小在93 kDa左右,能被6×His标签单抗和鼠多抗特异性识别。上述结果表明,该体外重组蛋白具有较好的抗原性。本研究为进一步探析毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白的功能和研制新型球虫亚单位疫苗奠定了基础。更多还原