N~6-腺苷酸甲基化RNA修饰在口腔慢性移植物抗宿主病中的作用及机制的初步研究

【作者】 江巧芝； 刘贞敏； 雍翔智； 陶人川；

【机构】 广西医科大学附属口腔医院；

【摘要】 目的:初步探讨m6A修饰在口腔慢性移植物抗宿主病(cGVHD)发生发展中的作用及相关机制。方法:1.通过MeRIP-seq构建口腔cGVHD(n=3)和无口腔cGVHD(n=3)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中RNA的m6A修饰谱文库,分析两组m6A修饰特点及差异。2.采用比色法和RT-qPCR检测口腔cGVHD(n=23)和无口腔cGVHD(n=23)患者PBMCs中m6A整体水平及相关调控因子的基因表达水平,ROC曲线和Spearman相关分析探究其对口腔cGVHD的诊断价值及与口腔临床表征评分的相关性。3. RNA免疫共沉淀结合RT-qPCR检测Jurkat T细胞系中m6A阅读蛋白YTHDF3与调节性T细胞(Tregs)关键因子FoxP3、STAT5B mRNA的结合情况;构建YTHDF3过表达、敲低的Jurkat T细胞系,RT-qPCR、Western Blot探究YTHDF3对STAT5B和FoxP3的基因和蛋白表达水平的影响;ELISA探究细胞上清液中IL-2、 IL-10和TGF-β的表达水平的变化;使用m6A抑制剂环亮氨酸探究m6A修饰水平对STAT5B表达水平的影响。结果:1.两组间具有显著性m6A修饰差异的基因有2724个,m6A修饰和RNA表达水平均有差异的基因有233个,这些差异基因主要涉及蛋白结合、白细胞迁移等生物功能,与FoxO、B细胞受体及IL-17等信号通路显著相关。2.两组患者PBMCs中的m6A整体水平无明显变化。相较于无口腔cGVHD组,口腔cGVHD组m6A相关调控因子METTL3、METTL16、RBM15和YTHDF3的mRNA表达显著下调,曲线下面积(AUC)分别为0.279(P=0.010)、0.356(P=0.095)、0.200(P<0.001)和0.313(P=0.030),RBM15联合YTHDF3的AUC最大,为0.792(P=0.001)。YTHDF3的mRNA表达水平与口腔cGVHD患者的口腔临床表征评分呈显著负相关(r=-0.516,p=0.012)。3. YTHDF3不与FoxP3的m RNA结合,但可与STAT5B的mRNA结合。过表达/敲低YTHDF3后,Jurkat T细胞中FoxP3的蛋白水平和m RNA表达均上调/下调;STAT5B蛋白表达水平上调/下调,其m RNA表达水平在过表达后上调,但在敲低后无明显变化;细胞上清液中IL-10和TGF-β的表达水平升高/降低。环亮氨酸处理后,细胞中m6A修饰水平下调,STAT5B的蛋白表达水平亦显著下调。结论:m6A修饰在口腔cGVHD中具有潜在的重要作用,YTHDF3可能通过以m6A修饰的方式靶向调控STAT5B,影响FoxP3的蛋白表达水平,影响Tregs的免疫抑制功能,与口腔cGVHD的发生发展相关。更多还原