有氧运动对高脂饮食诱导的肥胖小鼠心肌mRNAm6A甲基化修饰的影响

【作者】 徐祖杰； 张冰；

【机构】 清华大学；

【摘要】 研究背景:近年来,超重和肥胖已成为全球性公共卫生问题,其发生率呈显著上升趋势。研究表明,肥胖是心血管疾病的独立危险因素。长期重度肥胖导致心肌组织异位脂质沉积,炎症和氧化应激水平升高,心肌细胞发生坏死和凋亡,心脏结构和功能紊乱,严重损害心功能。研究发现,运动是预防和治疗代谢性心肌病的重要的非药物干预手段。运动可以通过抑制炎症和氧化应激水平、改善线粒体功能障碍和心肌脂毒性、抑制细胞凋亡和心肌纤维化以及调节表观遗传修饰等途径改善肥胖性心肌病,但其确切机制仍需进一步深入研究。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修饰作为表观遗传学的新兴组成部分,已被证实与缺血性心脏病、心力衰竭、动脉粥样硬化、肺动脉高压和高血压等心血管疾病密切相关。文献报道,运动可以通过下调m6A甲基转移酶METTL14的表达改善缺血再灌注诱导的心肌损伤。然而,m6A甲基化修饰是否在有氧运动改善高脂饮食诱导的肥胖性心肌重塑中发挥重要作用目前尚不清楚。研究目的:通过甲基化RNA免疫沉淀测序(Methylated RNA immunoprecipitation sequencing, MeRIP-seq)和转录物组测序(Transcriptome sequencing, RNA-seq),阐明mRNA m6A甲基化修饰在有氧运动改善肥胖性心肌重塑中的转录调控作用。研究方法:采用12周高脂饮食构建肥胖小鼠模型,然后进行8周的有氧运动干预,将C57野生型小鼠随机分为正常饮食组(ND)、高脂饮食组(HFD)和高脂饮食运动组(HFD-EX),每组均15只。通过超声心动图和病理组织染色评估心脏功能和结构;RT-qPCR检测m6A甲基化调节因子METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2的基因表达;比色法检测心肌m6A甲基化含量;采用m6A MeRIP-seq测序筛选mRNA甲基化修饰的差异性表达,并通过GO富集分析和KEGG通路分析预测其功能;将MeRIP-seq与RNA-seq的结果进行联合分析,进一步阐明m6A甲基化与基因表达之间的关系。研究结果:(1)有氧运动显著降低肥胖小鼠LVIDs和LVIDd,增加FS和EF,改善心肌组织结构损伤,提升心功能。(2)试剂盒结果显示,与ND组比较,HFD组小鼠心肌m6A甲基化水平显著增加,有氧运动显著降低肥胖小鼠心肌m6A甲基化水平。(3)RT-qPCR结果显示,与ND组比较,HFD组小鼠m6A甲基转移酶METTL3基因表达显著增加,去甲基化酶FTO基因表达显著降低;有氧运动显著抑制肥胖小鼠心肌METTL3基因表达,但对FTO基因表达无显著影响。(4)ND、HFD和HFD-EX组小鼠心肌m6A甲基化峰主要在终止密码子和3'-UTR中高度富集。ND组m6A位点3′UTRs的分布比例为47.1%;HFD组m6A位点3′UTRs的分布比例为46.83%;HFD-EX组m6A位点3′UTRs的分布比例为46.52%。(5)在ND、HFD和HFD-EX组中分别鉴定出19168、20178和21630个m6A峰,平均峰值长度为4156.8bp、4074.3bp和3979.42bp。(6)MeRIP-seq结果显示,ND组和HFD组比较共有575个m6A峰发生显著变化,其中290个峰上调,285个峰下调;HFD组和HFD-EX组比较共有879个m6A峰发生显著变化,其中358个峰上调,521个峰下调。(7)ND组和HFD组差异甲基化峰的平均峰值长度为3666.14bp;HFD组和HFD-EX组差异甲基化峰的平均峰值长度为2309.75bp。ND组和HFD组差异甲基化峰中5′UTRs的分布比例为24.7%、3′UTRs的分布比例为40.%;HFD组和HFD-EX组差异甲基化峰中5′UTRs的分布比例为17.75%、3′UTRs的分布比例为30.94%。(8)GO富集分析分为生物过程(biological process)、细胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)三个部分。ND组和HFD组差异甲基化的基因在生物过程部分主要富集在:轴突发生的正向调节、转录调控DNA模板、B-1a B细胞分化;在细胞成分部分主要富集在:核、核体、细胞骨架;在分子功能部分主要富集在:DNA结合、蛋白质结合、Ras鸟核苷酸交换因子活性。HFD组和HFD-EX组差异甲基化的基因在生物过程部分主要富集在:中性粒细胞趋化性的正向调节、细胞对趋化因子的反应、转录调控DNA模板;在细胞成分部分主要富集在:核、纤毛过渡纤维、睫状基底体;在分子功能部分主要富集在:蛋白质结合、DNA结合、核酸结合蛋白。(9)KEGG通路分析显示,ND组和HFD组差异甲基化的基因主要富集在前列腺癌(Prostate cancer)、调节干细胞多能性的信号通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)和长寿调节途径(Longevity regulating pathway-multiple species)等;HFD组和HFD-EX组差异甲基化的基因主要富集在Hedgehog信号通路(Hedgehog signaling pathway)、心肌细胞的肾上腺素能信号(Adrenergic signaling in cardiomyocytes)和内吞作用(Endocytosis)等。(10)RNA-seq结果显示,ND组和HFD组比较,共有780个差异表达基因,其中291个基因上调,489个基因下调;HFD组和HFD-EX组比较,共有399个差异表达基因,其中287个基因上调,112个基因下调。(11)MeRIP-seq与RNA-seq联合分析显示,ND组和HFD组比较,共有54个基因的m6A水平和mRNA表达发生显著变化,其中有31个基因m6A水平和mRNA表达均下调,有1个基因m6A水平下调而mRNA表达上调,有3个基因m6A水平上调而mRNA表达下调,有19个基因m6A水平和mRNA表达均上调;HFD组和HFD-EX组比较,共有40个基因的m6A水平和mRNA表达发生显著变化,其中有10个基因m6A水平和mRNA表达均下调,有3个基因m6A水平下调而mRNA表达上调,有14个基因m6A水平上调而mRNA表达下调,有13个基因m6A水平和mRNA表达均上调。研究结论:m6A甲基转移酶METTL3是有氧运动降低肥胖小鼠心肌m6A甲基化水平的关键调节因子。有氧运动可以导致肥胖小鼠心肌mRNA m6A修饰图谱的特异性改变。METTL3介导的mRNA m6A甲基化修饰是有氧运动改善肥胖性心肌重塑的潜在靶点。更多还原