运动预处理通过外泌体介导miR-29b对MCAO脑卒中大鼠脑细胞凋亡的影响

【作者】 王璐； 蒋彩云； 闫冬； 褚晶晶；

【机构】 成都体育学院；

【摘要】 研究目的:通过构建大鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤模型,观察运动预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用以及对大鼠血浆外泌体和脑组织中miR-29b表达的影响,探讨有氧运动通过外泌体介导miR-29b在缺血性卒中的具体作用机制,为运动通过外泌体介导miR-29b防治缺血性脑卒中损伤提供理论依据。研究方法:将60只健康雄性SD大鼠随机分为4组,分别是假手术对照组(Group Control,C组)、MCAO造模组(Group MCAO,M组)、单纯运动组(Group Exercise,E组)和运动MCAO造模组(Group Exercise+MCAO,EM),各15只。C组大鼠自由活动8周,接受假手术模型制作,充分暴露颈总动脉后缝合创口并消毒,不进行缺血再灌注处理;M组大鼠自由活动8周,接受MCAO手术模型制作,2h后进行缺血再灌注处理,E组和EM组大鼠在动物跑台连续运动8周后(6天/周,20m/min, 30min,坡度为0),E组大鼠采取充分暴露颈总动脉后缝合伤口并消毒;EM组大鼠接受MCAO手术模型制作,2h后进行缺血再灌注处理。在MCAO模型造模24h后,进行Longa神经行为学评分;TTC染色法评估脑梗死面积;尼氏染色和TUNEL染色观察皮层区域的脑组织病理变化;超速离心法提取外泌体,实时荧光定量PCR检测血浆外泌体和脑组织miR-29b表达;蛋白质印迹法检测缺血半暗带内p53,Bcl-2,Bax蛋白表达量;使用生物信息学网站(http://www.targetscan.org/)分析miR-29b和p53结合位点,双荧光素酶报告基因检测miR-29b与p53的靶向关系。采用SPSS21.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(mean±SD)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果:(1)8周后,各组大鼠体重变化无明显差别(P>0.05)。(2)通过longa评分法,淘汰0分和4分的大鼠,整体上造模成功率较好;C组和E组均未出现神经损伤;与C组相比,EM组和M组的大鼠行为学评分存在显著性差异(P<0.01,P<0.01),证明MCAO缺血性脑卒中造成神经性损伤;与M组相比,EM组大鼠行为学评分存在显著性差异(P<0.01),表明运动有改善神经性损伤的效果。(3)TTC染色测定脑梗死范围,C组与E组均未出现脑梗死的白色区域,EM组和M组均出现了白色梗死区域;与C组和E组相比,EM组和M组大鼠脑梗死面积百分比显著性增加(P<0.01,P<0.01);与M组相比,EM组大鼠脑梗死面积百分比显著性减少(P<0.01)。(4)尼氏染色结果显示,C组和E组神经元排列整齐紧密,神经元结构完整,尼氏体着色呈深蓝色,含量丰富;M组神经元排列疏松,神经元数量减少,尼氏体着色较浅,含量减少,说明缺血性脑卒中会损伤大脑神经元;与M组相比,EM组的神经元数量有所增加,尼氏体含量增多,说明运动对大脑神经元具有一定的保护。(5)TUNEL染色检测大鼠脑病理情况结果显示,在400倍荧光显微镜镜下观察各组大鼠病灶半脑缺血半暗带皮层细胞凋亡水平,处于凋亡状态下的细胞核表现为绿色的光点,处于正常状态下的细胞核表现为蓝色的光点。镜下观察发现,C组和E组皮层组织基本无凋亡,因此呈现出蓝色的光点;EM组可见少量的凋亡细胞,正常细胞更多,M组可见大面积细胞凋亡,呈现出绿色的光点;分析计数每张照片凋亡细胞数发现,C组与E组相比,缺血半暗带皮层的细胞凋亡数量无太大差别(P>0.05);与C组和E组比较,EM组和M组的细胞凋亡数量均显著增加(P<0.01),说明在脑缺血再灌注期间缺血半暗带皮层细胞凋亡;与M组相比,EM组缺血半暗带皮层细胞凋亡数量显著性减少(P<0.01),说明缺血再灌注前的运动预处理可能减少细胞凋亡的发生。(6)qPCR结果显示,C组与E组相比,E组血浆外泌体miR-29b和脑组织中miR-29b表达高于C组(P<0.05),说明运动预处理可以提高血浆外泌体和脑组织中miR-29b的表达;EM组和M组血浆外泌体miR-29b和脑组织中miR-29b均显著低于C组(P<0.01),说明缺血再灌注可能会降低血浆外泌体miR-29b和脑组织中miR-29b的表达;与ZM组比较,EM组血浆外泌体miR-29b和脑组织中miR-29b的含量显著增加(P<0.05),说明缺血再灌注前的运动预处理可能减少缺血再灌注期间血浆外泌体miR-29b和脑组织中miR-29b的丢失。(7)Western Blot检测结果显示,与C组比较,EM组和M组大鼠缺血半暗带内p53蛋白和Bax蛋白显著性增加(P<0.05),Bcl-2蛋白含量显著性下降(P<0.01),Bax/Bcl-2比值显著性上升(P<0.01);与M组相比,EM组大鼠缺血半暗带内p53蛋白和Bax蛋白含量显著性降低(P<0.01),Bcl-2蛋白含量显著性增加(P<0.01),Bax/Bcl-2比值显著性降低(P<0.01)。(8)通过双荧光素酶报告基因实验显示,与NC mimic组比较,miR-29b mimic组p53-WT的荧光素酶活性显著性降低(P<0.05),提示miR-29b靶向结合p53;当p53突变后,NC mimic和miR29b mimic荧光素酶活性没有显著性变化(P>0.05),表明miR-29b与p53存在特异性结合位点。研究结论:1)8周运动预处理能降低缺血再灌注大鼠的神经功能损害程度和减少脑组织梗死的体积。2)8周运动预处理可通过抑制p53的表达,调控Bcl-2和Bax的表达,降低Bax/Bcl-2的比例,减少缺血半暗带细胞凋亡率。3)8周运动预处理可以上调外泌体介导的大鼠血浆外泌体miR-29b和脑组织miR-29b表达水平,达到脑保护的作用。4)8周运动预处理可以通过外泌体介导增加血浆和脑组织中miR-29b的表达,抑制p53蛋白的表达,改变Bcl-2和Bax蛋白的表达,降低半暗带内细胞凋亡率,从而减少脑组织坏死,对脑缺血再灌注损伤有有益影响。更多还原