转录因子TabHLH39在小麦淀粉合成中的功能研究

【作者】 孟琰珺； 葛强； 郭天财； 康国章；

【机构】 河南农业大学；

【摘要】 【研究背景】淀粉是小麦籽粒中最主要的组成部分,约占总重量的75%左右,它决定了粒重和蒸煮品质。淀粉在胚乳细胞中的生物合成由一系列淀粉合成酶,经过复杂和高度受调控的反应生成,众多调控基因参与了淀粉的合成。淀粉合成酶的功能已经被广泛研究,然而小麦胚乳中淀粉合成酶基因的转录调控机制尚不清楚。团队前期利用酵母单杂交技术,分离出转录因子TabHLH39能与淀粉合成关键酶基因Ta AGPL1启动子相结合,可能调控了后者的表达,参与小麦籽粒淀粉的合成。【材料与方法】本研究应用转基因技术,验证TabHLH39对于小麦籽粒淀粉和粒重的调控;酵母单杂交技术、Luc活性测定和EMSA技术,证明了TabHLH39通过识别靶基因的E-box基序,激活基因的表达;应用PCR法,测定Tab HLH39序列在300余份小麦自然群体中的多态性分布,结合千粒重数据,关联分析并鉴定Tab HLH39的优异单倍型。【结果与分析】(1)转录因子TabHLH39在小麦根、茎、叶和籽粒中均有表达,而在籽粒内的表达量最高,可能在淀粉合成中发挥作用;亚细胞定位和转录活性分析表明TabHLH39是一个核定位的转录激活因子;(2)酵母单杂交实验、Luc以及EMSA实验均表明TabHLH39通过识别靶基因启动子区域的E-box基序,激活淀粉合成酶基因(Ta AGPS1、Ta BEⅡ-b、TaGBSSⅠ)的表达;(3)过表达Tab HLH39显著提高小麦籽粒的粒长、粒宽、千粒重,增强淀粉合成基因TaAGPS1、Ta BEⅡ-b、Ta GBSSⅠ的转录水平;(4)序列多态性分析发现TabHLH39-5A和Tab HLH39-5D的启动子区域和编码区域均未变化,而TabHLH39-5B的启动子区域和编码区域存在9个SNP多态性变异位点和4处Indels,形成了三种单倍型,分别命名为Hap1、Hap2和Hap3;(5)通过将TabHLH39-5B三种单倍型启动子分别与报告基因GUS和Luc连接,活性分析发现Hap2/Hap3启动子的转录活性较Hap1显著升高;同时,结合300余份小麦自然群体两年三个点的千粒重数据,发现具有单倍型Hap2/Hap3品种千粒重显著高于Hap1品种;综合分析发现Hap2/Hap3为Tab HLH39-5B的优异单倍型;此外,三个单倍型的SNP和内切酶位点,开发出TabHLH39-5B的CAPS-1807功能标记,可用于高粒重小麦新品种的选育;(6)克隆TabHLH39的同源基因OsbHLH39和ZmbHLH39,分别转化水稻和玉米,其均可以引起籽粒淀粉含量增加,籽粒变大;Luc试验表明发现OsbHLH39和ZmbHLH39均可以激活AGPS1、BEⅡ-b、GBSSⅠ的表达,说明作物中bHLH39功能保守,均可以正向调控籽粒淀粉的合成。【结论】(1)Tab HLH39正调控Ta AGPS1、Ta BEⅡ-b、TaGBSS1的表达,参与籽粒中淀粉的合成,影响粒重;(2)Hap2/Hap3是Tab HLH39-5B优异单倍型,并且其与千粒重成正相关;(3)b HLH39在小麦、玉米和水稻中功能具有普适性,均正向调控籽粒淀粉的合成。更多还原