鸡IL-18cDNA原核表达载体的构建与表达

【作者】 李银聚； 张春杰； 吴庭才； 程相朝； 杨国栋； 杨涛；

【机构】 河南科技大学动物科技学院；

【摘要】 本研究以BamHⅠ对已克隆并测序的PMD-T-ChIL-18克隆载体和PET-28a进行酶切,电泳并回收0.51kb的ChIL-18基因cDNA片段和5.36kb载体片段抽提纯化后,用T4DNA连接酶将ChIL-18基因cDNA连接到原核表达载体PET-28a相应的BamHⅠ酶切位点上构建了鸡IL-18cDNA原核表达载体,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序后证明IL-18基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而成功构建了鸡IL-18基因原核表达载体(PET-28a-ChIL-18)。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取单一菌落进行培养,提取质粒进行酶切鉴定。将质粒鉴定正确的转化菌落扩大培养。用5μL,10μL,15μL等不同剂量的IPTG进行诱导,并分别在诱导后3h,4h,5h提取样品,将样品进行以5000rpm离心5min,弃去上清液。用超声波破碎仪将沉淀物进行破碎,加85μL PBS煮沸5min使其变性,离心后将上清液和沉淀物分别进行SDS-PAGE电泳,对表达产物进行检测。结果发现在18KD处均有一条蛋白带,上清液中蛋白带较浅,说明蛋白量较少;沉淀中蛋白带较明显,蛋白量较多。从诱导剂量和诱导时间来看15μL IPTG诱导5h表达产物的量最高。经密度梯度扫描,表达产物约占总菌体蛋白的31%。表明鸡白介素-18基因cDNA在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了有效表达。表达产物多以包涵体形式存在。本试验为进一步研究白介素-18在原核细胞中的表达、功能以及作为免疫增强剂等基因工程产品的开发和应用奠定了基础。更多还原