禽流感非结构蛋白NS1-DIVA-ELISA检测方法的建立

【作者】 陈丽； 谢青梅； 李少璃； 马静云； 毕英佐； 曹永长；

【机构】 华南农业大学动物科学学院；

【摘要】 利用RT-PCR技术扩增了H5N1亚型禽流感病毒A株的NS1基因,ORF的长度为678bp。并成功构建了重组表达载体pBCX-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1mM/L的IPTG诱导表达,经12%的SDS-PAGE分析表明,在4h时表达量最大达48.25%。融合蛋白的分子量约为60KD,且80%以上以可溶形式表达,采用非变性方法对目的蛋白纯化,最终得到纯度约为93.44%的NS1蛋白。将纯化的NS1蛋白作为抗原,建立ELISA方法。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,不与灭活病毒免疫血清反应;用NS1蛋白检测直接攻毒与间接感染所获得血清,二者结果差异不显著,说明了本试验方法的敏感性。纯化的灭活病毒能消除尿囊液中少量NS1蛋白的影响,能进一步提高特异性。H5-NS1蛋白和H9NS1蛋白分别与H5N1、H9N2阳性血清反应差异不显著。本试验的建立的NS1-DIVA-ELISA方法不仅能区分感染禽群和免疫禽群,还能区分先免疫后感染禽群,虽不能区分亚型,但具有A型特异性,为生产上提供了一种快速、特异、敏感的诊断方法,也为禽流感的早期诊断和监控起到很好的作用。更多还原