有氧运动通过TRPA1调控肥胖大鼠附睾管腔Cl-与HCO3-稳态的机制研究

【作者】 高东东； 丁楠； 邓伟基； 李佩伦； 陈艺林； 郭连萌； 梁文豪； 钟嘉慧； 廖静雯； 黄俊豪； 胡敏；

【机构】 广州体育学院；

【摘要】 研究目的:肥胖或超重已成为影响人类健康的重要公共卫生问题,按照WHO标准,我国约有三分之一以上的成年人以及五分之一左右的未成年人存在超重或肥胖问题。男性生殖系统功能障碍是肥胖的常见并发症之一。尽管并非所有肥胖男性个体的生殖能力必然会受损,但相关临床数据显示近80%的男性生殖功能障碍患者可被归类为超重或肥胖。肥胖对雄性生殖功能的负面影响涉及精子在睾丸的产生及后续在附睾中的成熟过程,导致勃起功能障碍、精液质量下降,包括精子浓度降低、活力下降、形态异常,和临床前列腺炎等。其致病原因可归结于下丘脑-垂体-性腺轴紊乱、氧化应激、糖脂代谢紊乱、瘦素抵抗、肠道微生物失调、炎症等诸多方面。与许多其他疾病不同,肥胖及其并发症可以通过改变生活方式来逆转,适度的身体活动可以逆转肥胖个体的病理表现。大量研究表明体育锻炼可以改善肥胖个体失衡的精子指标,包括精子浓度和精子活力等。然而,肥胖对附睾精子成熟的影响及其潜在的机制目前仍不清楚。众所周知,附睾管腔液体中适宜的Ca²⁺,Na⁺,Cl^-,HCO₃^-,和K⁺浓度是精子在附睾移行过程中获得运动能力和受精能力的基础。之前的研究表明跨上皮离子吸收或分泌的紊乱可导致附睾精子活力下降。然而,运动干预以及肥胖是否可影响附睾上皮离子转运进而影响精子活力仍待探究。瞬时受体电位锚蛋白亚型1受体（the transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1）是一种Ca²⁺通透非选择性阳离子通道,已被证明与肥胖和女性不孕的病理过程有关。肥胖导致TRPA1在不同组织中的表达上调或下调,是肥胖的潜在治疗靶点。然而,TRPA1在附睾中的表达模式及其生理功能仍不清楚。基于此,本研究旨在研究高脂饮食（Hihg-fat diet,HFD）及运动干预对附睾上皮细胞TRPA1表达水平的影响,并揭示TRPA1促进附睾上皮离子转运的潜在细胞机制。揭示TRPA1作为运动干预的潜在靶点进而改善HFD诱导的肥胖大鼠附睾精子活力降低。研究方法:雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠以60kcal%脂肪热能高脂饲料（能量5.24kcal/g）饲养8周作为高脂饮食（Hihg-fat diet,HFD）诱导肥胖大鼠组,以10kcal%脂肪热能普通饲料（能量3.85kcal/g）饲养10周作为对照组,体重比对照组高20%,Lee’s指数比对照组高1.5%的大鼠为肥胖大鼠。随后,将大鼠随机分为正常饮食对照组（Normal diet control group,NC）,正常饮食运动组（Normal diet with exercise group,NE）,HFD对照组（HFD control group,HC）,HFD运动组（HFD with exercise group,HE）。运动干预组进行为期12周的正式有氧跑台训练,训练内容包括热身阶段（10 m/min,5min）;目标强度运动阶段（15m/min,50min;相当于55-65%VO2max,目标运动强度根据对大鼠最大摄氧量VO2max的测定进行适时调整）;放松阶段（8m/min,5min）,坡度为0%,训练频率为每周5次。通过qPCR、免疫荧光分析鉴定TRPA1定位及mRNA水平的表达状况,通过WB鉴定TRPA1蛋白的表达水平。利用在体附睾管腔微灌注以及离子色谱检测模型大鼠附睾管腔Cl^-浓度及分泌速率。利用CACA评估精子的运动活力状态。通过短路电流实验(short-circuit current,I_SC),细胞内Ca²⁺浓度测定实验、胞内c AMP浓度测定实验及PGE2生成量测定实验探究TRPA1促进附睾上皮离子转运的分子机制。研究结果:我们的实验数据显示有氧运动逆转了HFD诱导的肥胖大鼠附睾上皮细胞瞬时电压感受电位锚定蛋白1（transient receptor potential A1,TRPA1）表达的下调,改善了肥胖大鼠附睾管腔中的精子活力和Cl^-浓度的异常降低。上述结果表明,肥胖大鼠附睾管腔液中Cl^-浓度的失衡及可能TRPA1的表达下调相关。我们的短路电流(short-circuit current,I_SC)实验表明,TRPA1激动剂cinnamaldehyd（CIN）可诱发大鼠附睾尾部上皮短路电流的增加,且该反应可通过移除外界液体环境中Cl^-和HCO₃^-所阻断,表明CIN刺激诱发了附睾上皮细胞Cl^-和HCO₃^-的分泌。与此同时,我们的在体实验结果表明有氧运动可提高肥胖大鼠由CIN引起的附睾上皮细胞的Cl^-分泌速率。通过一系列药理学实验我们发现,阻断囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）和Ca²⁺依赖性Cl^-通道（calcium-activated chloride channel,CaCC）可抑制CIN诱发的附睾上皮细胞阴离子分泌。CIN可引起附睾上皮细胞内Ca²⁺浓度的显著升高,从而激活CACC。且Ca²⁺浓度的升高还可通过PGHS2-PGE2-EP2/EP4-cAMP信号通路促进CFTR介导的阴离子分泌。此外,基底侧Na⁺-K⁺-2Cl^-共转运体（Na⁺-K⁺-2Cl^-cotransporter,NKCC）也是跨上皮离子转运不可或缺的参与者。使用NKCC的抑制剂bumetanide（100μM,BL）预处理附睾上皮细胞可显著减弱CIN刺激引起的阴离子分泌。研究结论:本研究发现了有氧运动干预对HFD诱导的肥胖大鼠附睾上皮细胞TRPA1表达下调的逆转作用,揭示了TRPA1调控附睾上皮Cl^-和HCO₃^-分泌的分子机制。我们的研究表明运动干预可改善HFD诱导的肥胖大鼠附睾尾部液体中Cl^-和HCO₃^-稳态的失衡进而提升肥胖大鼠精子的活力。本研究表明在附睾上皮中TRPA1是HFD诱导肥胖和体育锻炼的潜在作用靶点,为疗肥胖引起的弱精子症等疾病的诊断和治疗提供了新的视角。更多还原