Asprosin对雄性小鼠生殖功能的影响及与运动关系的研究

【作者】 吕红艳； 衣雪洁； 姚婷婷； 李涛； 马雍琦； 贠志强； 张超； 温瑞明； 王肖；

【机构】 沈阳体育学院； 辽宁师范大学体育学院；

【摘要】 研究目的:脂肪因子参与雄性生殖功能的调节。新型脂肪因子白脂素(Asprosin,ASP)是否直接参与调控雄性生殖功能,还未见相关研究报道。适度的体育运动能够促进机体的生精机能,但关于有氧运动改善生精机能的分子机制目前尚不完全清楚,ASP很可能在雄性小鼠睾丸组织精子发生过程中起着特异性作用。因此,我们构建了FBN1基因65号外显子全身性敲除小鼠模型(FBN1+/-),通过交配生育试验、精子质量参数分析、HE染色、电镜等技术,对ASP在生殖中的作用进行初步探讨。此外,我们还对野生型小鼠和敲除型小鼠进行了有氧运动干预,观察生理水平下有氧运动对ASP的影响,为运动提高精子质量和改善生殖功能提供实验支撑和理论依据。研究方法:(1)SPF级C57BL/6J品系FBN1基因敲除型杂合子雄鼠(FBN1+/-)27只,14周龄,体重13-18g;同周龄WT雄鼠24只,体重27-34g;同周龄WT雌鼠17只,体重20-25g。适应性饲养2周后,随机选取12只WT雄性小鼠,分为对照组(WT,n=6)和实验组(WTAE,n=6);随机选取12只FBN1+/-雄性小鼠,分为对照组(KO,n=6)和实验组(KOAE,n=6),所有小鼠均标准饲料喂养。WTAE和KOAE组小鼠跑台运动干预,在正式运动期间,WTAE组小鼠的运动速度和持续时间由10m/min,20min/天逐渐增加到21m/min,60min/天,6天/周;KOAE组小鼠的运动速度和持续时间由10m/min,20min/天逐渐增加到18m/min,60min/天,6天/周,均持续运动训练12周。(2)将KO型和WT型雄鼠(14周龄)分别与雌鼠合笼5天,雄性:雌性=1:2,各组3个平行组,共计合笼4次,评价KO和WT雄鼠生育力,记录妊娠雌鼠数、产仔数。(3)最后一次训练结束后的36-40h各组取材,小鼠眼眶取血,分离血清,切开腹腔,解剖并游离出泌尿生殖系统,摘除各组小鼠生殖腺(睾丸、附睾和精囊腺)器官并称重,取单侧附睾制作成精子悬液,对精子质量参数进行评定,并制作精子涂片,记录精子典型形态及数量,睾丸组织置于4%多聚甲醛固定液或电镜固定液中固定,用于后续H&E染色和电镜切片,评价睾丸显微结构和超微结构。(4)所有数据处理均使用Graphpad Prism8.0统计软件分析并制图。两组间比较采用配对样本t检验。雄性小鼠生育力测试中妊娠雌鼠比例、仔鼠性别比例的数据结果采用Fisher精确检验进行统计分析。统计结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。研究结果:(1)与WT型小鼠相比,KO小鼠外形消瘦,体重、脂肪含量和Lee's指数均显著性下降,KO雄鼠生育力显著性下降,与之交配的雌鼠妊娠发生率、总产仔数量显著性下降,仔鼠性别比例无显著性差异。(2)与WT组小鼠相比,KO组小鼠的生殖腺重量(睾丸重量、附睾重量及精囊腺重量)均显著性下降,睾丸体积显著性下降;生殖腺系数(睾丸系数和附睾系数)显著性升高。(3)与WT组小鼠相比,KO组小鼠的精子密度无显著性差异,精子活力显著性下降,精子畸形率显著性升高。精子染色显示,WT组小鼠精子的头部呈镰刀形,精子体和精子尾部形态正常,KO组小鼠精子出现头部肿胀或畸形、精子颈部弯曲、精子尾部折叠等畸形变化。(4)通过H&E染色观察WT和KO组小鼠睾丸形态变化。在光学显微镜下可以看到,WT组小鼠睾丸组织生精小管呈圆形或近似椭圆形,生精小管饱满,细胞排列紧密,各层细胞发育正常并排列有序,官腔内可见较多成熟精子,KO组小鼠睾丸组织生精小管出现不规则形态,细胞排列疏松,生精细胞数量减少,杂乱无序,成熟精子数量减少。(5)透射电镜观察WT和KO组小鼠睾丸整体超微结构的变化。WT组基底膜完整,各生长周期的生精细胞排列紧密,细胞结构清晰,细胞核大而圆或卵圆形,细胞核膜完整,胞内基质电子密度均匀,细胞质中细胞器数目正常,官腔内可见较多精子;KO组睾丸组织出现细胞核膜溶解,染色质凝集,细胞器部分肿胀,生精细胞可见凋亡小体结构。(6)运动干预后,与WT组小鼠相比,WTAE组小鼠体重、脂肪、脂体比及Lee's指数均显著性下降,与KO组小鼠相比,KOAE组小鼠体重、脂肪、脂体比及Lee's指数均显著性下降。(7)运动干预后,与WT组小鼠相比,WTAE组小鼠生殖腺重量、睾丸体积均无显著性变化;睾丸系数显著性升高,精子密度和精子畸形率无显著性差异,精子活力显著性升高;与KO组小鼠相比,KOAE组小鼠精囊腺重量及系数显著性升高,精子密度、精子活力及精子畸形率无显著性差异。研究结论:(1)ASP敲除型雄性小鼠外形消瘦,其体重和脂肪含量降低45%-50%,这表明脂肪因子是ASP表达和分泌的主要组织器官。(2)ASP敲除型雄性小鼠生育力显著性下降,精子质量参数下调,表明ASP参与了雄性小鼠精子发生的调控,此外,ASP敲除型雄鼠生殖器官的发育可能滞后于正常同龄小鼠。(3)ASP敲除型雄鼠睾丸生精小管形态异常,排列松散,生精细胞减少,成熟精子减少,细胞核膜溶解,染色质凝集及凋亡小体结构。凋亡的发生可能是ASP敲除小鼠出现生殖功能下降的重要因素之一。(4)有氧运动可能促进细胞形态构建,进而改善组织器官功能。WT小鼠和KO小鼠进行有氧运动干预后发现,WT小鼠整体指标有所下降,睾丸系数和精子活力提升,KO小鼠整体指标下降,精子质量参数无显著性变化。因此,我们推测运动改善生殖功能可能是ASP参与的调控,后续我们对分子信号通路进行深入探讨。更多还原