游泳运动减轻尼古丁胁迫大鼠神经行为障碍及脑损伤的机制研究

【作者】 孔海军； 谌晓安；

【机构】 喀什大学体育学院； 吉首大学体育科学学院；

【摘要】 研究目的:现阶段尚缺乏有氧运动改善NS诱导神经行为障碍和脑损伤的直接证据。基于此,本研究拟探讨有氧运动对NS大鼠脑血管重塑、小胶质细胞活化和GABA能系统通路的干预作用,同时验证炎症反应在上述调节机制中的具体作用,从而为预防治疗NS诱导的脑损伤提供思路。研究方法:(1)研究对象与分组:40只6周龄SPF级雄性SD大鼠,体重(170±10)g,购自新疆医科大学医学实验动物中心,实验动物许可证编号:SYXK(新)2016-0002。动物于实验室条件适应性喂养3d后,随机分为4组,每组10只,分别为:假手术组(Sham组)、游泳运动组(Ex组)、尼古丁胁迫组(NS组)及尼古丁胁迫+游泳运动组(NS+Ex组)。各组大鼠自由饮食,饲养环境温度23～25℃,湿度55～60%,光照条件12h/d。(2)建模与运动方案:NS组和NS+Ex组大鼠接受尼古丁腹腔注射(2.5mg/kg·bw/d),连续4周,灭菌注射用水配置尼古丁所需浓度;Sham组和Ex组不接受腹腔药物给药,正常饲养。尼古丁胁迫模型建立后,Ex组和NS+Ex组大鼠进行适应性游泳训练,3d,1次/d,15min/次;Sham组和NS组不接受运动干预,正常饲养。适应性游泳训练后Ex组和NS+Ex组进行连续8周游泳运动(6d/w,40min/d)。(3)Morris水迷宫实验:每次实验前将大鼠置于无平台水池(圆形,180cm×180cm×60cm,水深50cm,水温23～25℃),自由游泳2min熟悉迷宫环境。实验持续4d,分为定位航行实验及空间探索实验。(4)样本提取:Morris水迷宫实验后即刻,麻醉、尾静脉取血,全血室温自凝45min,4℃、2000r/min离心10min,取上清即为血清;穿刺法取脑脊液;取脑组织,迅速剥离前额叶、纹状体、海马组织及下丘脑;分别取部分前额叶、纹状体、海马组织及下丘脑,加入PBS匀浆介质,1500r/min匀浆30s,匀浆液转移至离心管,4℃、6000r/min,离心10 min,取上清-80℃保存。(5)酶联免疫吸附试验:分别取脑皮层匀浆液和血清,加样并设空白孔和待测样品孔,37℃孵育20 min,磷酸缓冲液重复洗涤3次,待测样品孔加入酶标试剂液,37℃孵育20min,磷酸缓冲液重复洗涤3次,试剂盒显色,加入终止液,测OD值,浓度转换,以此检测白介素6(Interleukin-6,IL-6)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach), 5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)水平。(6)免疫组织化学染色:取大鼠海马组织,制作切片并脱蜡、复水,经抗原修复,分别加抗GFAP抗体(1:200)、抗Iba-Ⅰ抗体(1:200),4℃孵育过夜,PBS缓冲液清洗,二抗孵育,按照DAB显色试剂盒流程进行显色反应。(7)Western Blot检测蛋白表达量:取大鼠前额叶、纹状体、海马组织及下丘脑匀浆液样本,提取组织总蛋白,4℃,12000r/min离心20min;取上清液使用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度,加入5×SDS上样缓冲液,95℃变性15min。配置聚丙烯酰胺凝胶,浓缩胶恒压80V电泳30min,分离胶恒压110V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部,20μg上样,电转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入一抗(1∶1000稀释),4℃摇床孵育过夜;洗膜10min×3次,加二抗(1∶3000稀释),37℃孵育40min;洗膜10min×5次。增强化学发光显影,凝胶成像系统成像后使用Quantity One3.0软件分析,计算目的蛋白相对表达量。(8)统计学方法:采用SPSS 25.0统计学软件进行统计分析,数据以平均数±标准差(mean±SD)表示,两样本平均数间比较采用t检验分析,多样本平均数间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),组间比较采用LSD检验,P<0.05表示有显著性差异。研究结果:(1)有氧运动对NS大鼠空间记忆能力的影响:随学习时间延长,各组大鼠逃避潜伏期呈下降趋势。与Sham组比较,NS组大鼠3-4d逃避潜伏期显著增长(P<0.05);与NS组比较,NS+Ex组大鼠3-4d逃避潜伏期显著降低(P<0.05),Ex组1-4d逃避潜伏期显著降低(P<0.05)。与Sham组比较,NS组大鼠穿越平台次数显著降低(P<0.05),Ex组大鼠穿越平台次数显著提高(P<0.05);与NS组比较,NS+Ex组大鼠穿越平台次数显著上升(P<0.05)。(2)有氧运动对NS大鼠血清炎症因子的影响:与Sham组比较,NS组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著上升(P<0.05),Ex组大鼠血清TNF-α水平显著降低(P<0.05)。与NS组比较,NS+Ex组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P>0.05)。(3)有氧运动对NS大鼠脑脊液神经标记物的影响:与Sham组比较,NS组大鼠脑脊液Ach和5-HT水平显著降低(P<0.05),NSE水平显著上升(P<0.05);Ex组大鼠脑脊液Ach和5-HT水平显著上升(P<0.05),NSE水平显著下降(P<0.05)。与NS组比较,NS+Ex组大鼠脑脊液Ach和5-HT水平显著上升(P<0.05),NSE水平显著下降(P<0.05)。(4)有氧运动对NS大鼠前额叶、纹状体血管重塑蛋白表达的影响:与Sham组比较,尼古丁胁迫显著降低NS组大鼠前额叶和纹状体synapsin1和synaptophysin蛋白表达(P<0.05),Ex组大鼠前额叶和纹状体synapsin1和synaptophysin蛋白表达显著上升(P<0.05)。与NS组比较,NS+Ex组大鼠前额叶和纹状体synapsin1和synaptophysin蛋白表达显著上升(P<0.05)。(5)有氧运动对NS大鼠海马GFAP、Iba-Ⅰ表达的影响:与Sham组比较,NS组大鼠海马组织GFAP和Iba-Ⅰ阳性细胞占比和蛋白表达显著上升(P<0.05);Ex组大鼠海马组织GFAP和Iba-Ⅰ阳性细胞占比和蛋白表达显著降低(P<0.05)。与NS组比较,NS+Ex组大鼠海马组织GFAP和Iba-Ⅰ阳性细胞占比和蛋白表达显著降低(P<0.05)。(6)有氧运动对NS大鼠海马组织炎症和凋亡的影响:与Sham组比较,NS组大鼠海马NLRP3、NF-кB、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达显著上升(P<0.05),Bax蛋白表达显著降低(P<0.05);Ex组大鼠海马组织NLRP3和Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。与NS组比较,NS+Ex组大鼠海马NLRP3、NF-кB、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达显著下调(P<0.05),Bax蛋白表达显著上调(P<0.05)。(7)有氧运动对NS大鼠下丘脑GABA能系统通路的影响:与Sham组比较,NS组大鼠下丘脑GABAA-Rα1、NMDAR1和GAD65蛋白表达显著降低(P<0.05),GAD67蛋白表达显著上升(P<0.05);Ex组大鼠下丘脑GABAA-Rα1和GAD65蛋白表达显著上调(P<0.05)。与NS组比较,NS+Ex组大鼠下丘脑GABAA-Rα1、NMDAR1和GAD65蛋白表达显著上调(P<0.05),GAD67蛋白表达显著下调(P<0.05)。说明间歇有氧运动可有效激活尼古丁胁迫大鼠下丘脑GABA能系统通路。研究结论:本研究成功建立了尼古丁胁迫动物模型,游泳运动干预可通过抑制炎症和凋亡反应调控尼古丁胁迫大鼠脑血管重塑、海马组织小胶质细胞活化和GABA能系统通路功能,进而改善尼古丁胁迫大鼠空间记忆能力。更多还原