肠道菌群介导ASMT基因敲除和运动干预对小鼠抑郁行为的影响机制

【作者】 张野； 刘微娜； 漆正堂；

【机构】 华东师范大学；

【摘要】 研究目的:褪黑素（MT）被认为是"黑暗的化学密码",在调控昼夜节律中具有重要作用。MT的生物合成途径,特别是最后步骤的关键限速酶N-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶（ASMT）的有害突变被证明参与抑郁症等精神类疾病的发病过程。ASMT基因多态性与人群的抑郁症发病率有关,且抑郁症患者血浆ASMT的酶活性、mRNA及蛋白的表达降低,提示ASMT缺失可能导致抑郁行为。然而ASMT基因在抑郁症中的生理机制尚不明确。有研究发现,肠道菌群失调及其下游产物短链脂肪酸（SCFAs）的失衡与抑郁行为有关。MT可靶向肠道菌群调控应激诱发的抑郁行为,但敲除ASMT基因是否会影响肠道菌群和SCFAs尚需验证。运动可调节MT的水平改善抑郁,也能纠正异常的菌群结构、改善失衡的SCFAs水平恢复群落稳态,但运动的抗抑郁效应是否涉及ASMT、肠道菌群及SCFAs还需进一步探讨。探究ASMT基因敲除和跑台运动对小鼠抑郁行为的影响,并在此基础上明确ASMT基因敲除和跑台运动干预影响小鼠抑郁行为的机制是否与小鼠肠道菌群的群落结构和下游SCFAs的代谢变化有关,基于肠道菌群-SCFAs代谢轴探究运动抗抑郁的新机制。研究方法:实验选用ASMT基因敲除雌性纯合子小鼠12只,同窝生C57BL/6雌性野生型小鼠14只,6-7周龄,16-22g。实验组别为:（1）野生对照组（WT）:n=7;（2）ASMT基因敲除组（KO）:n=6;（3）野生+运动组（WE）:n=7;（4）ASMT基因敲除+运动组（KE）:n=6,共计4组。其中WE、KE组小鼠从8周龄开始进行为期8周跑台干预训练。训练结束后,收集运动组所有小鼠的粪便,再对所有组别小鼠进行经典的行为学测试,如糖水偏好实验、强迫游泳实验及悬尾实验。采用16SrRNA基因测序检测小鼠粪便样本中的群落结构和组成;采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测小鼠粪便样本中SCFAs的含量。研究结果:（1）抑郁的行为学实验结果显示,与WT小鼠相比,KO小鼠在FST中的不动时间显著增加（P<0.01）、挣扎时间显著减少（P<0.05）;在TST中的晃动时间显著减少（P<0.05）。与KO小鼠相比,KE小鼠在SPT中的糖水消耗量未见显著性差异;在FST中的不动时间未见显著性差异,挣扎时间未见显著性差异;在TST的不动时间显著减少（P<0.01）、晃动时间未见显著性差异。（2）小鼠粪便肠道菌群的多样性结果显示,就α多样性而言,与WT小鼠相比,KO小鼠PD-Whole-Tree指数显著下降（P<0.01）、Observed-species指数显著下降（P<0.05）、Simpson指数显著升高（P<0.01）。与KO相比,KE小鼠PD-Whole-Tree指数显著升高（P<0.05）、Observed-species指数显著升高（P<0.05）、Shannon指数显著升高（P<0.05）。稀释性曲线、Rank-abundance曲线及Specaccum曲线均显示WT、KO、WE、KE四组小鼠的物种丰度较高,物种分布较为均匀。就β多样性而言,Weighted UniFrac分析、PCoA分析及NMDS分析均显示WT、KO、WE、KE四组小鼠的肠道菌群多样性差异性较大。（3）小鼠粪便肠道菌群的丰度结果显示,与WT小鼠相比,在门水平上,KO小鼠拟杆菌门的丰度显著降低（P<0.05）,变形菌门、厚壁菌门及Epsilonbacteraeota的丰度显著升高（P<0.05）;在纲水平上,KO小鼠拟杆菌纲的丰度显著降低（P<0.05）,变形菌纲丰度极显著升高（P<0.01）;在目水平上,KO小鼠拟杆菌目的丰度极显著升高（P<0.01）,俊菌目、弯曲菌目的丰度显著升高（P<0.05）;在科水平上,KO小鼠Muribaculaceae的丰度极显著降低（P<0.01）,毛螺旋菌科、瘤胃球菌科的丰度极显著升高（P<0.01）,普雷沃氏菌科的丰度显著升高（P<0.05）;在属水平上,KO小鼠Lachnospiraceae_NK4A136_group、 Ruminococcaceae_UCG-014的丰度显著降低（P<0.05）, Alistipes的丰度显著升高（P<0.05）;在种水平上,KO小鼠Lactobacillus_murinus的丰度显著降低（P<0.05）。与KO小鼠相比,在门水平上,KE小鼠拟杆菌门的丰度显著升高（P<0.05）,厚壁菌门、变形菌门的丰度显著下降（P<0.05）;在纲水平上,KE小鼠拟杆菌纲、Campylobacteria的丰度显著升高（P<0.05）,梭菌纲的丰度极显著升高（P<0.01）、变形菌纲丰度显著下降（P<0.05）;在目水平上,KE小鼠拟杆菌目、俊菌目显著降低（P<0.05）,弯曲菌目的丰度极显著降低（P<0.01）;在科水平上,小鼠毛螺旋菌科、瘤胃球菌科的丰度显著下降（P<0.05）;在属水平上,KE小鼠螺杆菌属的丰度极显著升高（P<0.01）,Ruminococcaceae_UCG-014的丰度显著升高（P<0.05）;在种水平上,小鼠Mucispirillum_schaedleri_ASF457、Lactobacillus_murinus的丰度显著升高（P<0.05）。（4）靶向粪便SCFAs的代谢组学检测结果显示,与WT小鼠相比,KO小鼠粪便中总的SCFAs、乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸的水平极显著升高（P<0.01）,异戊酸、己酸的水平显著升高（P<0.05）。与KO相比,KE粪便中总的SCFAs、乙酸、异丁酸水平显著下降（P<0.05）、丁酸的水平极显著升高（P<0.01）。（5）抑郁行为与肠道菌群、SCFAs的相关分析结果显示,小鼠在FST中的不动时间与Alistipes的丰度呈显著正相关（P<0.05）,与Prevotellaceae_UCG-001的丰度呈极显著正相关（P<0.01）。小鼠在FST中的挣扎时间与Alistipes、Odoribacter的丰度均呈显著负相关（P<0.05）,与Prevotellaceae_UCG-001的丰度呈极显著负相关（P<0.01）;抑郁行为与CFAs无显著相关性。（6）肠道菌群与SCFAs相关分析结果显示,Bacteroides的丰度与己酸呈显著负相关（P<0.05）,Ruminiclostridium₉的丰度与己酸呈极显著负相关（P<0.01）,Turicibacter的丰度与己酸呈显著负相关（P<0.05）;Blautia丰度与戊酸呈显著正相关（P<0.05）;Mucispirillum的丰度与异戊酸呈显著正相关（P<0.05）; Turicibacter的丰度与丁酸呈十分显著的负相关（P<0.001）;Ruminiclostridium₉的丰度与异丁酸呈显著负相关（P<0.05）。研究结论:（1）ASMT基因敲除可诱发小鼠的抑郁行为,并导致肠道菌群紊乱、SCFAs代谢失衡,而运动可改善ASMT基因敲除导致的抑郁行为,并纠正异常的肠道群落结构,缓解失衡的SCFAs水平,特别是上调丁酸水平,提示肠道菌群的丁酸代谢在介导运动的抗抑郁中可能发挥重要作用。（2）肠道菌群Alistipes、Odoribacter及Prevotellaceae_UCG-001的丰度增加,Roseburia的丰度减少与抑郁行为的发生呈正相关;Bacteroides、Ruminiclostridium₉、Turicibacter、Blautia及Mucispirillum的丰度变化与SCFAs的代谢失衡有关。更多还原