冬虫夏草繁育品中一个碱溶多糖-蛋白复合组分Fn4具有诱导巨噬细胞M1型极化活性

【作者】 艾铃愉； 钱正明； 吴君； 赵博洋； 冯慧琴； 李文佳； 杨晓彤；

【机构】 上海师范大学生命科学学院微生物与免疫学研究所； 东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司国家中医药管理局冬虫夏草繁育与产品研发重点研究室；

【摘要】 巨噬细胞是一类数量多且具有重要生理功能的免疫细胞,有很强的可塑性和多能性,在不同的生理和病理环境中可极化成不同的类型,产生不同的表型和功能。M1和M2型为两种主要极化类型,M1型巨噬细胞具有促炎和抗肿瘤作用,而M2型则有抗炎和促肿瘤作用,两种极化类型可互相转化。肿瘤微环境中存在大量的M2型巨噬细胞,减少M2型细胞数量或诱导向M1型极化是肿瘤免疫治疗的策略。一些天然产物包括部分真菌多糖能诱导巨噬细胞M1型极化。我们从东阳光冬虫夏草繁育品的碱提物中分离到一个多糖-蛋白复合物并研究了其体外诱导巨噬细胞M1型极化的活性。冬虫夏草繁育品用乙醇和热水分别提取除去醇溶和水溶性成分后,用3%NaOH溶液在10℃和氮气保护下提取24 hr,得到碱提取物NCAP。NCAP用DE52阴离子交换柱层析分离,用含0-1.0 mol/L NaCl的pH 7.0、0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液梯度洗脱,依次得到三个组分。再用0.5 mol/L NaOH洗脱得到组分Fn4。ELISA测定显示NCAP及四个组分中诱导巨噬细胞产生TNF-α的活性以Fn4的为最强。理化表征分析发现Fn4不溶于水但可溶于稀碱,主要由多糖和蛋白质组成,含量比为1.89:1.00。HPLC-SEC法测定分子量为40615 Da。用Sevag法处理4次后Fn4丢失了80%的物质,并且丧失了刺激巨噬细胞产生一氧化氮及TNF-α的活性。Fn4经SDS-琼脂糖(1%)凝胶电泳后再转移印迹至PVDF膜,分别进行考马斯亮蓝(蛋白)及Schiff试剂(多糖)染色,结果两种染色条带位于同一水平位置。这些结果提示Fn4中多糖和蛋白形成复合物,且蛋白或糖-蛋白复合物是产生免疫活性的关键。β-消除反应显示多糖和蛋白质间为O-连接,四极杆轨道阱质谱分析发现Fn4中主要有三种蛋白质成分,分别为T5ACM3、T5A562和Linoleate 8Rlipoxygenase。PMP衍生后反相HPLC分析测得多糖中单糖组成及摩尔比为Glc:Man:Gal:GalUA:Fuc:GlcN=1.00:0.071:0.059:0.049:0.035:0.017。以佛波酯诱导人THP-1细胞分化形成的未极化M0型巨噬细胞为模型,发现Fn4 (100和200μg/mL)能上调TNF-α、IL-1β、IL-12和CD80等M1极化表型的相关基因表达、下调M2型极化表型相关基因中CCL18和CD206的表达,对IL-4的基因无调控作用。将这些极性表型相关基因进行主成分分析,结果显示Fn4诱导M0型巨噬细胞向M1型而不是M2型极化。进一步用Fn4刺激后的巨噬细胞培养液(CM)与人结直肠癌细胞HT-29共同培养,发现对HT-29有抑制活性,相对抑制率为6.8%(p<0.01),而单独的Fn4相对抑制率仅为1.72%(p>0.05 vs control, p<0.05 vs CM),提示Fn4是间接通过刺激巨噬细胞M1型极化来产生对人结直肠癌细胞的抑制作用。综上所述,我们从冬虫夏草中繁育品的碱提物中分离到一个多糖-蛋白质复合物,可诱导巨噬细胞M1型极化,具有免疫刺激活性。更多还原