食用菌MNP标记库构建及品种鉴别技术开发

【作者】 张拓； 魏传正； 谢路昱； 吕志文； 杨环； 王朦； 谢宝贵；

【机构】 福建农林大学菌物研究中心； 新加波国立大学计算机科学学院；

【摘要】 目前食用菌的品种鉴别方法有SSR、ISSR、SCAR、AFLP等,均是以PCR为基础,分析扩增产物片段长度多态性。这些方法在应用时需要把大量的近似品种作为对照,工作量大、耗时,并且经常由于引物错配而出现假阳性的结果。鉴于二代测序技术十分成熟、价格低廉、数据可靠,本研究收集了国内外主栽品种和部分野生菌株作为建库菌株,在基因组测序的基础上,用bowtie2将各个样品测序数据比对到参考基因组,使用GATK检测SNP,选取次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>0.05的SNP,滤去缺失率>20%的SNP,最后滤去测序深度不足50的SNP,获得用于形成MNP的SNP。以100bp为窗口扫描整个基因组,选取包含SNP个数在2到10个的窗口作为MNP标记,即每个窗口(100bp序列包含2～10个SNP)定义为1个MNP(多核苷酸多态性,multiple nucleotide polymorphism)标记。分别计算每个MNP的多态性信息量(polymorphism information content,PIC),按PIC从大到小排序,选择互不重叠、PIC>0.5、MNP之间的距离>50 kb的MNP构成MNP标记库。本研究构建了金针菇、杏鲍菇和真姬菇的MNP标记库,它们的MNP标记总数分别为428、503和369个。在品种鉴别时,待检品种的MNP与菌株库中各品种逐一进行MNP基因型比对,统计MNP基因型相同的数量(n),计算两菌株间的遗传相似度(GS),GS=n/N×100%,N为MNP标记库中MNP标记总数(金针菇N=428,杏鲍菇N=503,真姬菇N=369)。本课题组租用阿里云服务器建设了"食用菌分子鉴别工作站"(http://www.mrclab.top/),免费提供"种类鉴别"、"品种鉴别"、"杂交菌株鉴别"和"分子标记筛选"等服务,其中"分子标记筛选"因为需要巨大的计算量,我们租用的服务器仅可分析遗传相似度高的品种,为它们寻找≥200bp的差异片段。该工作站目前仅能分析金针菇、杏鲍菇和真姬菇三种食用菌。用户仅需上网提交二代测序数据便可分析,约5小时便可获得分析结果。当用户提交分析的品种有别于菌株库中的菌株时,该工作站将自动增加新菌株MNP等位基因、升级MNP标记库。本研究建立的食用菌MNP标记品种鉴别技术,仅需上传待检菌株的二代测序数据,无需提供对照品种或近似品种,具有准确、稳定、可靠、工作量小、成本低等特点。更多还原