一株马铃薯疮痂病病原菌的系统鉴定及其生物防治

【作者】 张家辉； 张铭铄； 高峥； 周波；

【机构】 山东农业大学生命科学学院；

【摘要】 马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界第四大粮食作物。现阶段中国马铃薯种植面积位居世界首位,但存在较多的病害问题,其中疮痂病是严重影响马铃薯生产经济效益的因素之一,该病是由疮痂链霉菌引起的病害,会导致产量下降和品质劣化甚至无法食用等问题。因此,尽早对病原菌进行识别并进行针对性防治对于马铃薯生产与粮食安全至关重要。疮痂病病原菌的遗传多样性研究需要有可靠标准的鉴定方法作为支撑,国际链霉菌计划(International streptomyces project, ISP)是由国际微生物学会放线菌分会(American Society for Microbiology, ASM)组织实施的,为链霉菌分类鉴定提供了可靠的模式菌株及可行方案。随着分子生物学发展,多相分类法鉴定病原菌逐渐应用广泛,特别是16S r RNA序列测定等技术提高了鉴定的准确性。然而,在中国马铃薯主要种植区疮痂病病害发展日趋严重,但目前对疮痂病依然缺乏有效的防治措施。研究拟从发病的马铃薯疮痂病病斑处分离疮痂病病原菌,通过盆栽试验、致病基因检测等方法对分离菌株进行致病性验证,并通过形态学、生理生化特征及分子生物学方法对病原菌进行系统鉴定;以分离的病原菌株为靶标从马铃薯内生细菌中筛选拮抗效果较好的生防菌株,在此基础上利用盆栽试验进一步验证生防菌株的防治效果。研究从马铃薯疮痂病发病部位分离得到一株链霉菌株AMCC400023,试验分别使用小薯片法与萝卜幼苗检测法验证链霉菌的致病性,病原菌Streptomyces scabies菌株与链霉菌AMCC400023处理薯片10 d后,均表现出薯片表面中心颜色变深,并且薯片与病菌接触部位有结疤痕迹,未接菌处理薯片无变化;采用链霉菌发酵液处理萝卜苗后与空白对照相比,表现出对萝卜苗生长的显著抑制作用,抑制率达到88.2%,而采用病原菌S.scabies菌株发酵液处理的萝卜苗抑制率为84.7%。随后通过对分离链霉菌株AMCC400023盆栽回接验证试验进行致病性测定,栽培90 d后收获马铃薯统计,检测表明该菌株具有疮痂病致病性并能够在块茎上形成典型的疮痂病斑,严重发病区域病斑深度达3～5 mm,发病率为86.24%。从发病块茎上分离链霉菌,提取菌株DNA后采用txt AB1/txt AB2引物扩增得致病基因txt AB的目的条带。通过使用PAI致病岛中参与致病的txt AB基因、nec1基因与tom A基因的特异性引物对S.bottropensis(CGMCC4.1699)、S.scabies(ACCC41024)及AMCC400023进行PCR扩增,结果显示后两者均含有3种致病基因,测序结果显示AMCC400023的txt AB、nec1和tom A序列与S.scabies(EU864252.1, AM253591.1, FJ007481.1)的基因序列相似性分别为100%、 99%和100%。采用燕麦琼脂(Oatmeal agar, OMA)培养基在28℃下将AMCC400023培养14 d以观测其形态学特征,随后在酪氨酸培养基上鉴定其生理生化特征。结果表明,可产生黑色素,可利用D-葡萄糖、 D-甘露醇等ISP糖类,可利用L-组氨酸、 L-甲硫氨酸作为氮源,能够耐受结晶紫、苯酚与部分抗生素并且在p H 4.5及5.0%NaCl浓度培养基中生长,但是无法在p H 4.0或10.0%NaCl浓度培养基中生长。随后通过发育树构建与保守序列特异性扩增鉴定AMCC40023为S.bottropensis。之后从健康马铃薯块茎中分离得到78株内生细菌,采用滤纸片法初筛得到21株拮抗菌,采用牛津杯法复筛得到3株抑菌效果较好的菌株Ua、Me、 Ma。并且对3株菌株继代划线培养15次后测定菌株抑菌效果依然稳定,表明3株拮抗菌遗传稳定性较好。在春季盆栽试验中,验证表明拮抗菌Ua、 Me对疮痂病的生防效果分别达到53.36%和52.24%,而Ma仅为30.03%。秋季栽培试验中,拮抗菌Ua、 Me对疮痂病防治效果分别达到67.92%和64.98%,比春季栽培防治效果略有提升且稳定性较好。盆栽试验结果证明, Ua菌株、 Me菌株在高浓度的情况下,能显著降低马铃薯疮痂病的发病率、发病等级、发病系数,具有较好的生防效果,并且两次盆栽试验生防效果比较稳定。对马铃薯根际土壤微生物数量测定表明,添加拮抗菌Ua及Me高浓度发酵液处理的细菌总数显著性提高,而放线菌数量则显著性降低。将拮抗菌Ua和Me在LB平板上37℃培养24 h以观察其形态学特征,二者均为革兰氏阳性芽孢杆菌;以《常见细菌系统鉴定手册》为指导进行, 2个菌株的生理生化鉴定表明,二者均好氧生长,其他如接触酶、葡萄糖产酸、阿拉伯糖产酸等特征均相同;二者在55℃环境下不能生长,但pH 5.7环境下可以生长。以细菌16sRNA与gyrA基因的引物对Ua与Me进行特异性扩增,所得片段测序后建树表明, Me、 Ua菌株与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)亲缘关系最近,因此认定二者为甲基营养型芽孢杆菌。随后对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌等9种真菌病原菌株的抑菌谱测定表明,拮抗菌Ua、 Me滤菌上清液对9株病原真菌都具有一定的抑菌效果,抗菌谱较广。对链霉菌抑菌能力测定结果显示, Ua与Me对非致病链霉菌ACCC40027、 ACCC40024、 ACCC40121、 CGMCC4.1699均具有一定的抑菌效果,但抑菌效果显著性低于疮痂病致病链霉菌ACCC41024。目前报道的芽孢杆菌类生防菌剂对疮痂链霉菌的抑菌物质包括伊枯草菌素A、macrolactin A及LCI蛋白等,而这些物质可能会对其他非致病链霉菌具有抑制作用。拮抗菌Ua、 Me产生的抑菌物质经不同温度、 pH及有机溶剂处理后,依然保持较好的抑菌活性,表明拮抗菌株抑菌物质稳定性较好。酶活测定表明,拮抗菌Ua、 Me具有蛋白酶活及纤维素酶活力,不具有几丁质酶及果胶酶活力。研究结果表明,分离的内生拮抗细菌Me及Ua菌株在马铃薯疮痂病防治中具有较好的应用前景,但关于内生拮抗细菌最佳施用方法、施用浓度、在土壤及马铃薯植株内的定殖情况及对生态环境影响等还需要进一步研究明确。更多还原