【作者】 张漫； 张威； 赵亚杰； 陈晓娇； 王冕； 谭桂玉； 王保民；

【Author】 Zhang Man;Zhang Wei;Zhao Yajie;Chen Xiaojiao;Wang Mian;Tan Guiyu;Wang Baomin;College of Agronomy,China Agricultural University;

【机构】 中国农业大学农学院；

【摘要】 转Bt基因棉花已在全世界范围内得到广泛种植。有关Bt棉花生物安全性的研究,前人在土壤中Bt蛋白的来源和动态变化、Bt蛋白对土壤生态系统的影响、Bt棉田昆虫种群变化和环境安全等方面已进行了大量研究。而在Bt蛋白在土壤中降解、代谢、转移以及代谢产物对土壤微生物和非转基因作物的影响方面报道较少。本文利用土壤链霉菌所分泌的蛋白酶研究了Bt Cry1Ac的代谢,鉴定了Bt Cry1Ac蛋白降解的大分子片段和小分子多肽,并研究了代谢产物在土壤中的转移及对所转移的作物和土壤微生物的影响。（1）合成Bt cry1Ac基因,构建到质粒pGEX-4T-1中。将重组质粒Bt cry1 Ac-pGEX-4T-1转化到大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导原核表达融合蛋白。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化蛋白,制备原核表达的Bt Cry1AC蛋白用于降解转化试验。（2）利用土壤链霉菌蛋白酶降解Bt Cry1Ac蛋白,降解产物经毛细管高效液相色谱串联质谱鉴定出1 1种小片段多肽,其中多肽A～F（NDMNSALTT、TNPVLEN、GNAAPQQR、SNTVPATATSLDN、ATSLDNLQSSD、SLDNLQSSD）在重复试验中稳定存在,多肽G～K在重复试验中偶尔存在。将降解产物中的2条主要大片段多肽通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分离后通过Edman降解法与质谱法联用,对这2条片段进行N端测序,1号多肽N端的前10位氨基酸序列是NH₂-ETGYTPIDIS-COOH （30～39）,2号多肽N端的前10位氨基酸序列是NH2-GNNQQLSVL-COOH （3 74～3 83）。将SDS-PAGE中的大片段多肽进行胶内酶切后,再进行质谱检测分析,最终确定1号多肽C端范围360～373,2号多肽C端范围602～648。（3）用氯铵-T法将¹²⁵I标记人工合成多肽NH₂-YTNPVLEN-COOH的酪氨酸苯环,将¹²⁵I-多肽溶液添加到小麦西瓜幼苗的根系土壤中,分时间段取样检测幼苗各组织中放射性强度变化。1 h后2种作物各组织中均有显著的放射性强度变化:西瓜茎、叶和小麦茎、叶中放射性最大值分别是3.038 2X10^-2μCi·g^-1、2.879×10^-3μCi·g^-1和3.999 6×10^-2μCi·g^-1、1.006 7×10^-2μCi·g^-1,是对照组对应茎、叶的120倍、14.6倍和19.5倍、8.4倍。种植在灭菌土壤的幼苗组织中放射性强度明显高于种植在非灭菌土壤中的幼苗,在同样的时间里,小麦幼苗里的放射性强度显著高于西瓜幼苗。同时幼苗茎中的放射性强度普遍高于叶中的强度,符合了¹²⁵I-多肽是由根吸收,先转移到茎再转移到叶的过程。（4）从大田土壤分离固氮菌、解钾细菌和解有机磷细菌,分别向培养基中添加3种鉴定的代谢片段,多肽对它们的生长无显著影响;将3种多肽溶液喷施于小麦、西瓜和玉米叶片,测定3种作物的生理指标（可溶性蛋白、总糖、叶绿素和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD））,所测生理指标无显著差异。更多还原