矮壮素对TM3细胞睾酮合成的影响及1.6

【作者】 王晓霞； 肖倩倩； 康陈萍； 郝卫东；

【机构】 北京大学公共卫生学院毒理学系食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室；

【摘要】 目的矮壮素(Chlormequat chloride,CCC)是一种应用广泛的植物生长调节剂。我们前期的研究发现,CCC可引起青春期雄性大鼠发育延迟、精子参数异常和睾酮合成降低等。本研究旨在探讨CCC对小鼠睾丸间质细胞系(TM3)睾酮合成的影响及机制。方法采用不同浓度的CCC(0、3.125、12.5、50、200和800μg/mL)处理TM3细胞24小时,用MTT法检测细胞毒性;采用Elisa检测细胞上清的睾酮水平,RTqPCR检测睾酮合成相关基因的表达水平;采用流式细胞术检测细胞周期,线粒体膜电位,细胞凋亡水平;采用WB和RT-qPCR检测内质网应激(ERS)相关蛋白和基因的表达水平;采用Flou-4 AM和Rhod-2 AM荧光探针分别检测细胞质和线粒体内的钙离子水平;采用内质网和线粒体荧光探针,经激光共聚焦显微镜共定位分析CCC对TM3细胞内质网-线粒体结构偶联(MAMs)的影响。采用ERS抑制剂(4-PBA)和CCC共同处理TM3细胞,检测ERS相关蛋白和基因的表达、细胞凋亡及相关蛋白的水平和睾酮含量。结果不同浓度CCC处理的TM3细胞活力均大于80%;50、200和800μg/mL CCC处理可引起TM3细胞睾酮合成降低;800μg/mL染毒组的睾酮合成相关基因水平(Star、Hsd3b2和Tspo)降低;200和800μg/mL染毒组GRP78和CHOP的蛋白和基因表达增加;各剂量组的细胞周期和线粒体膜电位无明显变化,50、200和800μg/mL染毒组的细胞凋亡水平增加,且800μg/mL CCC可引起Bax、Caspase-3、PARP和Caspase-9的蛋白表达增加,Bcl2的蛋白表达降低;200和800μg/mL CCC可引起细胞质内的钙离子水平增加,而各剂量组线粒体内的钙离子水平较对照组降低,且800μg/mL CCC使细胞内钙调蛋白和钙调神经磷酸酶的水平增加;CCC可引起MAMs相关蛋白(Mfn2和VDAC1)的表达降低,且内质网与线粒体的共定位系数(Pearson’s和Manders系数)降低也间接反应MAMs数量减少;与CCC染毒组比较,4-PBA+CCC处理组睾酮水平增加,GRP78蛋白水平和细胞凋亡水平降低。结论 CCC可引起TM3细胞睾酮合成降低,其机制可能与ERS介导的细胞凋亡和钙离子稳态失衡有关。更多还原