高效广适性水稻碱基编辑系统的开发及其应用

【作者】 任斌； 严芳； 闫大琦； 旷永洁； 柳浪； 徐子妍； 王桂荣； 周雪平； 周焕斌；

【机构】 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室；

【摘要】 随着植物抗/感病基因的不断挖掘和抗病信号通路不断被解析,利用基因组编辑技术直接对作物品种中的感病基因进行敲除或对抗性相关的碱基变异直接进行碱基编辑,从而实现对植物抗病性的快速精准改良。由CRISPR系统(CRISPR1.0)与核苷酸脱氨酶为基本架构的植物碱基编辑器(CRISPR2.0)作为一种重要技术手段在植物学基础研究和作物品种改良中得到了广泛应用。然而,由于碱基编辑靶碱基位点的固定性、SpCas9的NGG识别PAM和有效碱基编辑窗口等因素,使得碱基编辑的应用范围受到严重限制。此外,相对于高效的胞嘧啶碱基编辑器CBE,腺嘌呤碱基编辑器ABE的编辑效率还不尽人意,不少基因组靶位点的编辑效率较低,甚至为零,严重限制了该技术的应用。为了扩宽水稻单碱基编辑系统的识别PAM范围,笔者首先对SpCas9的两个新型突变体SpG和SpRY在水稻中编辑效果进行了详细分析,发现SpG偏好性地识别NG PAM,其活性低于之前获得的SpCas9-NG;SpRY则进一步突破NG的限制,对NRN和NYN均有一定的编辑能力,其中对G-PAM和A-PAM具有偏好性;并基于SpRYn成功建立了水稻胞嘧啶碱基编辑器rBE66和腺嘌呤碱基编辑器rBE62;此外还发现SpRY具有高频的自编辑事件,而在SpRY介导的碱基编辑中,自编辑频率较低。这表明SpRY可用于水稻单碱基编辑,并极大扩宽了水稻单碱基编辑的应用范围。为了实现对现有植物腺嘌呤碱基编辑器的优化升级,笔者首先对腺嘌呤脱氨酶TadA7.10衍生版本TadA8e、TadA8.17、TadA8.20进行了评估,并在此基础之上开发出全新版本TadA9,进一步采取TadA单体策略以及整合SurroGate系统,多个测试靶位点处的碱基编辑效率逐步提高至90%以上,基本类似于CRISPR技术进行靶基因敲除的表现。在四种新TadA突变体中,TadA8e的编辑能力明显高于TadA8.17和TadA8.20,而TadA9的编辑能力与TadA8e相当甚至更高且扩大了编辑窗口范围。尤其是对于之前难以编辑的靶位点,TadA9表现出强劲的编辑能力。笔者还证实了TadA9与SpCas9n、SpCas9n-NG、SpRYn和ScCas9n等SpCas9突变体和同源蛋白广泛兼容。结合笔者前期开发的高效胞嘧啶脱氨酶hAID*Δ,CRISPR/SpRY和TadA9的应用,使得水稻碱基编辑技术进入了高效广适性时代,这对于水稻基因功能解析和现代分子育种研究具有重大推进作用,特别是对水稻品种的缺陷型抗病基因进行修饰矫正和利用碱基编辑介导的内源基因定向进化策略创制和挖掘新的抗病遗传种质资源,有利于加快水稻抗病育种进程以及延长现有品种使用周期。更多还原