土壤中马铃薯黑腐果胶杆菌的荧光定量检测方法

【作者】 谭娇娇； 张世昌； 郭成瑾； 王喜刚； 郭荣君； 沈瑞清； 李世东；

【机构】 宁夏大学农学院； 宁夏农林科学院植物保护研究所； 中国农业科学院植物保护研究所；

【摘要】 马铃薯黑胫病是一种世界性的细菌病害,在世界各地均有分布。黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)是引起马铃薯黑胫病的主要病原菌,该病原主要通过切刀、水流和土壤带菌传播。马铃薯黑胫病菌可在土壤中存活,依附病株残体可存活更长时间。笔者在前期研究中发现黑腐果胶杆菌是宁夏马铃薯黑胫病的重要致病菌,分离频率高、分布广泛,而且在多年连作地块发病严重,因此非常有必要建立土壤中黑腐果胶杆菌的监测方法,以实现马铃薯黑胫病的早期监测和预警。Boer (1995)报道利用引物Eca1f/Eca2r可特异性扩增黑腐果胶杆菌(P.atrosepticum),扩增条带约690 bp。程亮(2020)报道,利用16S rRNA基因通用引物和果胶裂解酶基因特异性引物ADE1/ADE2可对马铃薯软腐病菌(P.carotovorum subsp.carotovorum)和黑胫病菌(P.atrosepticum)进行区分,并明确西北地区马铃薯黑胫病的主要病原菌为P.atrosepticum。杨松等(2009)建立了马铃薯黑胫病荧光定量PCR检测体系,但目前尚缺少土壤中黑腐果胶杆菌的荧光定量监测方法。笔者利用引物Eca1f/Eca2r,根据荧光定量扩增要求,共设计了11对荧光定量PCR引物,其中引物paf4/par4可从宁夏黑腐果胶杆菌分离株中特异性扩增出长度约为152 bp的单一条带。为了检测该引物对土壤中黑腐果胶杆菌扩增特异性,笔者从宁夏不同地市和北京采集土壤,然后加入黑腐果胶杆菌,还采集了盆栽发病植株周围土壤,提取DNA后,进行荧光定量扩增。结果表明:所建立的荧光定量反应体系可从上述土壤DNA中扩增出黑腐果胶杆菌的特异性条带,溶解曲线峰单一,峰尖锐,说明所建立的荧光定量体系适用于复杂土壤环境中目标菌的检测。在此基础上,建立了目的基因重组质粒标准曲线,y=0.996x+36.813,R~2=0.996,扩增效率为107.3%,检测下限为1.39×10 copies/mL。通过在土壤中加入黑腐果胶杆菌菌悬液,制备浓度为7.70×10~7cfu/g～7.70×10~2cfu/g的带菌土壤,建立了土壤中黑腐果胶杆菌荧光定量标准曲线,方程为y=0.825 8x-0.879 8,R~2=0.992 5,对应的目的基因重组质粒检测下限为3.88×10 copies/mL,可用于马铃薯黑胫病带菌土壤的定量检测,为马铃薯黑胫病的监测预警提供了技术和方法。更多还原