CRISPR/Cas12a-RPA体系检测南方水稻黑条矮缩病毒方法的建立

【作者】 段雪艳； 马文娣； 焦志远； 周涛； 范在丰；

【机构】 中国农业大学植物保护学院农业部作物有害生物监测与绿色防控重点实验室；

【摘要】 南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)可侵染水稻、玉米等禾本科作物与杂草,具有传播快、突发性强、范围广等特点。SRBSDV侵染造成水稻矮缩、不抽穗,严重影响水稻的产量和品质。因此,建立特异、灵敏、快速的早期病毒检测方法尤为重要。近几年,重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术已广泛应用于病原物检测领域。RPA在恒温条件下对目的片段进行循环扩增,打破了PCR技术需要温控设备的局限性。将提取的SRBSDV阳性样品总RNA反转录成cDNA,结合RPA技术可实现快速高效扩增。目前,基因编辑工具CRISPR/Cas系统越来越多地应用于核酸检测领域。CRISPR/Cas12a能够识别数个核苷酸的特定原型间隔子相邻模体(protospacer adjacent motif,PAM)序列(LbCas12a能够识别5’-TTTN-3’);在crRNA的引导下,切割双链靶标DNA;切割dsDNA后,能够激活其切割ssDNA的活性。基于CRISPR/Cas12a的这一切割活性,笔者结合RPA技术建立了SRBSDV的快速可视化核酸检测体系。在该检测体系中,加入带有FAM荧光基团的报告探针ssDNA,Cas12a切割报告探针后产生绿色荧光,在紫外灯下肉眼可见检测结果。相较于传统的RT-PCR检测,该方法灵敏度高,扩增速度快,反应时间短,高效简便,不需要复杂的仪器设备;适用于现场快速检测,为基层植保部门进行病害早期诊断与及时防控提供依据。更多还原