苹果树褐斑病菌快速检测技术研发与应用

【作者】 张丽霞； 常亚莉； 王英豪； 徐亮胜； 黄丽丽；

【机构】 旱区作物逆境生物学国家重点实验室/西北农林科技大学植物保护学院；

【摘要】 由Marssonina coronariae引起的苹果褐斑病是导致我国苹果树早期落叶的主要病害,该病害在日本、韩国、加拿大、印度、意大利等国均有报道。每年因该病害发生而引起叶片大量提早发黄脱落,流行年份重病园7—9月的落叶率高达80%～100%,严重影响果品产量和品质。由于该病害潜伏期长、流行速度快,一旦发生,难以控制,因此有必要开发一种快速、灵敏且可靠的田间检测方法,以便在苹果叶片无症状时有效诊断苹果褐斑病。环介导等温扩增（LAMP）是一种新型检测方法,特异性强、灵敏度高、操作过程简单、检测结果可视化。由于该检测不需要昂贵的设备或专业技术,因此基于LAMP的诊断方法可以在田间条件下应用,以更准确、更有效地掌握苹果园的苹果褐斑病的发病情况,从而进行精准防控。因此,为了建立苹果树褐斑病菌特异性的可视化LAMP检测方法,本研究基于苹果树褐斑病菌的ITS-rDNA序列,设计了LAMP检测方法的4条特异性引物并获得阳性结果。通过控制单因素变量,测试LAMP反应的最优体系,确定了反应最优的Mg²⁺浓度为4mM,甜菜碱浓度为0.2M,最佳反应温度为62℃,反应时间为50min。在特异性试验中,只有27株苹果树褐斑菌均可观察到绿色荧光的阳性结果,而10株对照菌和阴性对照结果均为橙色的阴性结果。在灵敏性试验中,LAMP检测最低检测限700fg/μl,孢子悬浮液的最低检测限为100个/ml。因此,本研究建立苹果树褐斑病菌特异性的可视化LAMP检测方法将应用于田间褐斑病的早期检测,为该病害的早期精准防控提供依据。更多还原