长链非编码RNA LINREP促进胶质瘤进展的作用机制研究

【作者】 辛涛； 刘倩； 纪小帅；

【机构】 山东第一医科大学第一附属医院神经外科； 山东大学基础医学院； 山东大学；

【摘要】 目的筛选与胶质瘤可变剪接调控密切相关的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lnc RNA),探索lnc RNA与可变剪接相关蛋白的相互作用关系及对下游靶基因的调控作用,明确lnc RNA调控胶质瘤进展的分子机制。方法联合胶质瘤组织lnc RNA表达谱芯片与剪接因子PTBP1的RIP-seq测序,筛选出与胶质瘤可变剪接密切相关的lnc RNA。通过体内外功能实验验证lnc RNA LINREP对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响,通过RNA-seq分析在胶质瘤中LINREP和PTBP1调控的可变剪接类型,筛选出LINREP和PTBP1共同调控的最显著变化的可变剪接靶基因,明确LINREP与PTBP1的相互作用关系及对下游靶基因的调控作用,最后通过RNA甲基化免疫共沉淀(MeRIP)、逆转录PCR技术(RT-PCR)等实验从6-甲基化腺嘌呤(N6-methyladenosine,m~6A)修饰角度探究LINREP的上游调控机制。结果联合RIP-seq和lncRNA芯片分析,筛选在胶质瘤/瘤旁/正常脑组织中差异表达并与PTBP1特异性结合的lnc RNALINREP,进一步实验证实LINREP与PTBP1/HuR蛋白复合体结合。LINREP敲除后,胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显降低,而过表达LINREP后胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强。LINREP过表达组荷瘤鼠颅内瘤体体积更大,且生存期明显缩短。机制研究表明LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径,延长PTBP1蛋白的半衰期。RNA-seq测序显示LINREP和PTBP1主要调控转录本的外显子跳跃突变,其中以RTN4的第3个外显子跳跃突变最为显著。MeRIP实验证实LINREP存在高水平的m~6A甲基化修饰,甲基转移酶METTL3可显著增强LINREP的m~6A甲基化修饰,从而促进HuR与m~6A修饰的LINREP结合,延长其RNA半衰期。结论 LINREP通过与PTBP1直接结合,抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径以增强PTBP1蛋白稳定性,从而调控下游一系列致癌基因的可变剪接事件,尤其是参与RTN4 3号外显子跳跃,最终促进胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为。此外,METTL3介导LINREP的m~6A甲基化修饰,促进HuR结合并稳定m~6A修饰的LINREP,导致LINREP表达上调。更多还原