结直肠癌肝转移相关乙酰化修饰蛋白的筛选与验证

【作者】 杨长江； 赵龙； 林易霖； 叶颖江； 王杉； 申占龙；

【机构】 北京大学人民医院；

【摘要】 目的:远处转移是影响结直肠癌患者预后的重要因素,肝脏是结直肠癌远处转移的重要靶器官。目前对于结直肠癌肝脏转移的机制尚未完全探究清楚。赖氨酸乙酰化修饰是一种与细胞内的多种生物学过程密切相关的重要蛋白质翻译后修饰。本研究旨在深入探讨结直肠癌远处转移过程中蛋白质乙酰化修饰的改变,为进一步了解蛋白质乙酰化修饰在结直肠癌中的作用奠定基础。材料与方法:收集北京大学人民医院手术切除的新鲜结直肠癌及配对肝转移组织样本,通过TMT(Tandem Mass Tag)标记,乙酰化修饰肽段富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等对样本中的乙酰化修饰蛋白进行鉴定。以1.2倍为变化阈值筛选结直肠癌肝转移相关差异乙酰化蛋白及位点。对筛选得到的蛋白质进行系统的生物信息学分析以透彻这些蛋白的功能及特征。通过STRING蛋白网络互作数据库挖掘差异乙酰化蛋白的相互作用关系,通过Cytoscape软件中的cytoHubba插件分析蛋白互作网络中的关键蛋白。构建上述蛋白质粒,通过免疫沉淀实验,用赖氨酸乙酰化抗体检测其乙酰化水平。随后依据质谱获得的差异乙酰化位点,构建上述蛋白的乙酰化位点突变质粒,行免疫沉淀后检测个蛋白乙酰化水平改变以验证相应位点的乙酰化修饰。结果:本研究共收集结直肠癌肿瘤组织及配对肝转移组织的新鲜标本共3对。通过乙酰化蛋白质组定量研究,相较于肿瘤组织,配对肝转移组织中47个蛋白的287个乙酰化位点上调,59个蛋白的198个乙酰化位点下调。蛋白修饰的基序分析显示,xxxK_K_Sxxx,xxxY_K_Nxxx,xxxF_K_Nxxx是乙酰化修饰最丰富的基序。对差异修饰蛋白进行亚细胞结构预测和分类统计表明,差异乙酰化蛋白主要分布于细胞浆(32.69%)以及细胞核(21.15%)。基因本体论(Gene Ontology,GO)以及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明,差异乙酰化蛋白则主要参与补体活化及凝血,糖代谢等过程。通过cytoHubba插件中的MCC,DMNC,MNC,Degree,EPC共5种方法分别计算前20位蛋白并取交集,结果显示纤维蛋白原α链(Fibrinogen alpha chain,FGA),玻连蛋白(Vitronectin,VTN)以及纤溶酶原(Plasminogen,PLG)等则是参与结直肠癌肝转移的重要乙酰化蛋白。通过免疫沉淀实验验证了上述蛋白及对应位点的乙酰化修饰。结论:本研究鉴定了结直肠癌肝转移过程中的差异乙酰化蛋白及位点,为进一步了解乙酰化修饰在结直肠癌远处转移中的作用提供了理论基础,并为结直肠癌肝转移的诊断和治疗提供了潜在的分子标志物及治疗靶点。更多还原