外泌体中miR-let-7c通过介导巨噬细胞极化促进多发性骨髓瘤血管生成

【作者】 田翔宇； 孙淼淼； 陈超； 李辉； 陈奎生；

【机构】 郑州大学第一附属医院； 郑州大学；

【摘要】 目的:探讨多发性骨髓瘤中骨髓间充质干细胞(BMMSCs)来源的外泌体中miR-let-7c对血管生成的影响。方法:1.收集并原代培养多发性骨髓瘤患者的BMMSCs,并通过流式细胞仪检测其表面标记STRO-1,CD105及CD90对其鉴定。采用超高速离心法及试剂盒法两种方法提取培养上清的外泌体,通过透射电子显微镜,纳米颗粒跟踪分析仪分及流式细胞仪方法检测表面标志物CD63,CD81对外泌体进行鉴定。2.采用密度梯度离心法及CD14磁珠阳性分选法收集并筛选出外周血巨噬细胞,与BMMSCs及外泌体分组培养后应用流式细胞仪检测M2型TAMs表面标志物CD206的表达情况,采用qRT-PCR检测各组MΦs中miR-let-7c的表达情况。采用共聚焦显微镜观察外泌体被MΦs摄取的情况。3.构建miR-let-7c过表达及抑制的稳定慢病毒感染细胞株,采用qRT-PCR验证各组MΦs中miR-let-7c的过表达及抑制水平,通过流式细胞仪检测感染前后M2型TAMs表面标志物CD206的水平变化。4.分离并鉴定多发性骨髓瘤患者的骨髓瘤血管内皮细胞(MVECs),将细胞与极化后的M2细胞及巨噬细胞分组培养,分别运用CCK-8试剂盒,划痕实验,Transwell迁移实验及小管形成实验检测共培养前后MVECs的增殖能力,迁移能力及体外成环能力变化。结果:1.BMMSCs来源的外泌体呈典型的双层膜茶托样结构,其粒径中20-200 nm范围占71.5%,CD63和CD81表面蛋白均呈阳性表达(分别为81.1%和91.7%)。2.外泌体共培养组M2特异性标志物CD206的水平明显升高(P<0.01),且与外泌体共培养后细胞内miR-let-7c的水平明显上调(P<0.01)。在共聚焦显微镜下可见PKH26标记的外泌体向DAPI染色的巨噬细胞胞浆内聚集。3.miR-let-7c过表达组极化为M2型TAMs比例较对照组明显增加(P<0.05)而抑制组M2型TAMs比例则减少(P<0.01)。4.运用CCK-8试剂盒检测结果显示,MVECs与M2共培养72 h后,细胞增殖能力出现明显增强(P<0.05)。通过划痕实验和Transwell迁移实验证实,MVECs在与M2共培养72 h后细胞迁移能力明显增强(P<0.01),小管形成实验结果显示,MVECs在与M2共培养72 h后细胞体外成管能力明显增强(P<0.01)。结论:BMMSCs释放的外泌体中miR-let-7c可以诱导巨噬细胞极化为M2型,从而在多发性骨髓瘤的血管生成起促进作用。更多还原