CD3ζ链引入YRHQ基序显著促进靶向Her2的CAR-T细胞抗肿瘤活性

【作者】 王田； 张征峥； 王晓峰； 张紫梦； 宋淑霞；

【机构】 河北医科大学；

【摘要】 目的:探索在CD3ξ链胞内区羧基末端引入YRHQ基序,能否提高靶向Her2的CAR-T细胞对肿瘤特异性杀伤活性。方法:通过DNA合成获得包含靶向Her2的scFv及CD28、CD3ξ(或引入YRHQ基序)胞内区编码嵌合抗原受体H28ξ或H28ξ(YRHQ)的DNA片段。通过慢病毒载体分别将该DNA片段转导健康人外周血T细胞,制备H28ξ-CAR-T及H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞。将2种CAR-T细胞分别与Her2阳性的SKOV3、MDA-MB-453和Her2阴性的MCF-7细胞共孵育,LDH释放法检测CAR-T细胞的杀伤活性,ELISA方法检测IL-2、IFN-γ和GZMB的水平,Western Blot方法检测stat3的磷酸化水平及免疫检查点分子TIM-3、PD-1的表达。流式细胞仪检测细胞表面CCR7、CD45RO的表达,分析初始T细胞(TN) CCR7~+CD45RO、效应T细胞(TEFF) CCR7~-CD45RO~-、中央记忆T细胞(TCM) CCR7~+CD45RO~+及效应记忆T细胞(TEM) CCR7~-CD45RO~+等不同亚型T细胞分布。结果:H28ξ-CAR和H28ξ(YRHQ)-CAR在T细胞的表达率分别为33.3%±2.85%和28.30%±3.2%。在效靶比为5:1、10:1及20:1时,H28ξ-CAR-T和H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞对肿瘤特异性杀伤及IL-2、IFN-γ和GZMB释放水平均显著高于正常T细胞(P<0.05或P<0.01)。含YRHQ基序的CAR-T细胞表现为更高的杀伤活性及stat3的磷酸化水平(均P<0.01),但PD-1和TIM-3的表达未见明显改变。与SKOV3肿瘤细胞共培养后,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞中TEM表型的细胞,较NTT与H28ξ-CAR-T比较明显增加,而TCM表型的细胞明显减少(P<0.05)。H28ξ-CAR-T细胞亚群与NTT没有明显区别。结论:H28ξ-CAR-T和H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞均显示出肿瘤特异性杀伤活性。在肿瘤抗原刺激后,带有YRHQ基序的CAR-T细胞stat3磷酸化水平、细胞毒活性及TEM细胞亚群比例均明显升高。表明在CD3ξ链胞内区引入YRHQ基序可在一定程度上提高CAR-T细胞快速杀伤潜力。更多还原